樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的抗胃癌過繼免疫治療的臨床前研究.pdf

1、胃癌是威脅人類健康的常見惡性腫瘤之一。目前的治療方法，包括根治性手術(shù)切除、化療、放療及其他綜合治療等，均未能有效提高腫瘤病人的治愈率和生存率，且大多數(shù)病人預(yù)后很差。樹狀細(xì)胞(Dendriticcell，DC)作為重要抗原呈遞細(xì)胞(Antigenprecentingcells，APC)中的一員，具有高效攝取、加工、提呈腫瘤相關(guān)抗原，并激活初始免疫反應(yīng)的獨(dú)特功能，因而成為腫瘤免疫治療中一個(gè)非常有希望的方法。然而，許多研究表明在腫瘤病人體內(nèi)D

2、C的數(shù)量下降，并且功能受到了不同程度的抑制，DC不能有效攝取、處理、提呈腫瘤抗原，使T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答不能被有效激活。國(guó)、內(nèi)外己有許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，將DC在體外誘導(dǎo)活化，能夠使其功能從腫瘤微環(huán)境下的免疫抑制狀態(tài)完全恢復(fù)，用這些功能完善的DC細(xì)胞體外激活初始T細(xì)胞，將活化后的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)過繼回輸，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性保護(hù)免疫反應(yīng)，抑制體內(nèi)腫瘤組織的生長(zhǎng)，甚至達(dá)到腫瘤部分或完全消

3、退的療效。近年來歐美一些主要實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)用外周血單核細(xì)胞來源的DC所進(jìn)行的臨床Ⅰ期和Ⅱ期研究，同樣觀察到特異性T細(xì)胞抗腫瘤免疫反應(yīng)，并獲得腫瘤部分消退的結(jié)果。 由于胃癌細(xì)胞缺乏特異性腫瘤抗原，且是多基因致病，針對(duì)單一腫瘤抗原或抗原肽的治療方案，可能存在克隆性腫瘤逃避、轉(zhuǎn)移病灶抗原缺失/突變等許多不利因素，從而導(dǎo)致抗腫瘤免疫治療效果不佳或失敗。此外，單一抗原的治療方案還受腫瘤病人HLA配型的限制。采取腫瘤細(xì)胞裂解物或總mRNA等腫瘤

4、細(xì)胞全抗原的治療方案，可有效克服單一腫瘤抗原方案所存在的缺陷。全抗原包含多種已知或未知腫瘤抗原，可由MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子提呈給T細(xì)胞。經(jīng)全腫瘤抗原負(fù)載的DC有可能誘導(dǎo)激活多克隆T細(xì)胞擴(kuò)增，并包括MHC-Ⅱ分子限制的輔助T細(xì)胞。輔助T細(xì)胞在誘導(dǎo)產(chǎn)生CTL及抗腫瘤免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用。因此，在克服腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性及抗原調(diào)變方面，腫瘤多抗原特異性的CTL較單一抗原特異性CTL具有明顯優(yōu)勢(shì)。另外，應(yīng)用病人自體全腫瘤抗原無需進(jìn)行HLA

5、配型。該策略潛在的最大問題是可能誘發(fā)自身免疫性疾病。然而臨床試驗(yàn)很少觀察到自身免疫的發(fā)生。用細(xì)胞因子進(jìn)行腫瘤免疫治療是腫瘤免疫學(xué)研究的另一個(gè)熱點(diǎn)?；A(chǔ)及臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IL-12和IL-2在體內(nèi)具有顯著的抗腫瘤作用，但由于該作用依賴于外源性大劑量IL-2和IL-12的持續(xù)輸注，往往伴隨嚴(yán)重的毒副作用，從而限制了其臨床應(yīng)用。然而，當(dāng)小劑量聯(lián)合應(yīng)用IL-12和IL-2時(shí)，卻顯示出良好的協(xié)同作用，不僅能刺激CTL持久增殖，且能促使CTL發(fā)揮

6、更強(qiáng)大的殺瘤活性。 以DCs為基礎(chǔ)的抗腫瘤免疫治療作為傳統(tǒng)治療的重要輔助手段，近年來發(fā)展迅速。一些歐美發(fā)達(dá)國(guó)家的研究機(jī)構(gòu)已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)，并取得了初步療效，而在我國(guó)此項(xiàng)研究多處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。由于自體原代腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)相對(duì)困難，大多臨床前研究使用替代靶細(xì)胞，如HLA配型相同或不同的異源腫瘤細(xì)胞株，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能反映不出CTL在體內(nèi)的真實(shí)殺傷活性。本研究利用負(fù)載胃癌患者自體全腫瘤抗原的DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL作為效應(yīng)細(xì)胞，以短期培養(yǎng)

7、的自體原代腫瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞，用小劑量IL-12和IL-2作為輔助手段，通過體外殺傷實(shí)驗(yàn)，對(duì)個(gè)體化腫瘤免疫治療進(jìn)行臨床前客觀評(píng)價(jià)，以期為進(jìn)一步開展臨床抗腫瘤過繼免疫治療提供一種高效、低毒性的治療方法。 本研究分以下三個(gè)方面：第一部分樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)及其功能學(xué)研究目的：探討體外培養(yǎng)條件下樹突狀細(xì)胞體的生物學(xué)特征及制備理想抗原提呈細(xì)胞的最適條件。 方法：在細(xì)胞因子rhGM-CSF、rhIL-4及TNF-α的作用下，誘導(dǎo)外周血

8、單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)來源的DC發(fā)育成為成熟樹突狀細(xì)胞(matureDC，mDC)；計(jì)數(shù)DC數(shù)量并繪制生長(zhǎng)曲線；應(yīng)用流式細(xì)胞儀及混合淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)方法(mixedlymphocytereaction，MLR)，檢測(cè)DC的免疫功能狀態(tài)；應(yīng)用熒光標(biāo)記及流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間DC的吞噬能力。 結(jié)果：培養(yǎng)第5d的未成熟樹突狀細(xì)胞(immatureDC，imDC)具有強(qiáng)大

9、的吞噬能力；mDC的HLA-DR、CD80、CD83和CD86的表達(dá)水平明顯上調(diào)，同時(shí)獲得高效刺激自體T細(xì)胞增殖的能力，與imDC比較差異顯著(p＜0.05)；生長(zhǎng)曲線顯示：培養(yǎng)至7d的mDCs數(shù)量較第5d的imDCs明顯減少，在7d后繼續(xù)培養(yǎng)過程中還觀察到，每隔3d，DC的數(shù)量幾乎成倍衰減。 結(jié)論：在細(xì)胞因子rhGM-CSF、rhIL-4及TNF-α作用下可獲得具有理想抗原提呈能力的mDC。 第二部分腫瘤裂解物負(fù)載樹突

10、狀細(xì)胞行胃癌個(gè)體化免疫治療的實(shí)驗(yàn)研究目的：探討負(fù)載自體腫瘤細(xì)胞裂解物的成熟樹突狀細(xì)胞(ATL-mDC)體外誘導(dǎo)個(gè)體化抗胃癌過繼免疫治療的效應(yīng)。 方法：建立短期培養(yǎng)的原代胃癌細(xì)胞系。用ATL-mDC激活自體T細(xì)胞，制備腫瘤特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞。應(yīng)用流式細(xì)胞儀及混合淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)方法，檢測(cè)樹突狀細(xì)胞的免疫功能狀態(tài)；應(yīng)用細(xì)胞毒殺傷試驗(yàn)驗(yàn)證腫瘤特異性CTL的殺傷活性；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbe

11、ntassay，ELISA)測(cè)定IL-12和INF-γ的分泌水平。 結(jié)果：ATL-mDC的HLA-DR、CD80、CD83和CD86表達(dá)水平明顯上調(diào)，同時(shí)獲得高效刺激自體T細(xì)胞增殖的能力；ATL-mDC上清液中IL-12的濃度顯著高于單純成熟DC(t=15.47，P＜0.01)及未成熟DC(t=28.44，P＜0.01)。三組DCs分別激活自體T細(xì)胞產(chǎn)生的CTL上清液中INF-γ的濃度：ATL-mDC組高于單純成熟DC組(t=4

12、.84，P＜0.05)，并顯著高于未成熟DC組(t=13.74，P＜0.01)；ATL-mDC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL對(duì)自體胃癌細(xì)胞的殺傷效率(84±11％)顯著高于對(duì)兩株異體胃癌細(xì)胞的殺傷效率(18.61±7.08％；19.30±10.71％)(t=54.18～56.46，P均＜0.01)。 結(jié)論：ATL-mDC體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL能有效地特異性殺傷自體胃癌細(xì)胞，其殺傷效率顯著高于對(duì)兩株異體胃癌細(xì)胞的殺傷效率，結(jié)果提示臨床采用個(gè)體化免

13、疫治療應(yīng)該是有效和確實(shí)可行的。 第三部分樹突狀細(xì)胞轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞總RNA介導(dǎo)個(gè)體化免疫治療的實(shí)驗(yàn)研究目的：探討樹突狀細(xì)胞轉(zhuǎn)染胃癌患者自體腫瘤細(xì)胞總RNA，體外介導(dǎo)抗胃癌免疫治療的效應(yīng)。 方法：建立短期培養(yǎng)的原代胃癌細(xì)胞系。用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α體外誘導(dǎo)胃癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞來源的DC成熟；應(yīng)用轉(zhuǎn)染自體腫瘤細(xì)胞總RNA的成熟樹突狀細(xì)胞，激活自體T細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤特異性CTL。應(yīng)用流式細(xì)胞儀及混合淋巴細(xì)胞增

14、殖反應(yīng)方法，檢測(cè)未成熟和成熟DC的免疫功能狀態(tài)；用CCK-8試劑盒檢測(cè)腫瘤特異性CTL的殺傷活性；應(yīng)用ELISA測(cè)定IL-12和INF-γ的分泌水平。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染自體腫瘤細(xì)胞總RNA的成熟DC，不僅高表達(dá)MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ抗原及CD80、CD83、CD86，并獲得高效刺激自體或異體T淋巴細(xì)胞增殖的能力；轉(zhuǎn)染RNA成熟DC組的IL-12分泌水平均顯著高于單純成熟DC組及未成熟DC組；轉(zhuǎn)染RNA的成熟DC所激活的CTL，其上清中

15、INF-γ分泌水平較單純成熟DC及未成熟DC所激活的CTL明顯增高，其對(duì)自體胃癌細(xì)胞的殺傷效率較異體細(xì)胞顯著增高。 結(jié)論：轉(zhuǎn)染自體胃癌細(xì)胞總RNA的成熟DC能夠體外誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)自體腫瘤細(xì)胞具有高度抗原特異性及殺傷活性的CTL。 第四部分負(fù)載自體腫瘤裂解物的樹突細(xì)胞體外輔以小劑量IL-2及IL-1增強(qiáng)CTLs抗自體胃癌活性的研究目的：目前以DC為基礎(chǔ)或細(xì)胞因子輔助的免疫治療分別顯示出良好抗癌療效。然而，大劑量細(xì)胞因子所產(chǎn)生的

16、毒副作用以及單純應(yīng)用DC疫苗僅能獲得30％左右的有效率，這一事實(shí)大大限制了腫瘤免疫治療的臨床應(yīng)用。本研究探討負(fù)載自體腫瘤細(xì)胞裂解物的成熟樹突狀細(xì)胞(tumorlysateloadedmatureDC，TL-mDC)體外輔以小劑量IL-2及IL-12誘導(dǎo)過繼免疫抗胃癌的治療效果，為腫瘤免疫治療的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：將短期培養(yǎng)的原代胃癌細(xì)胞系作為靶細(xì)胞。應(yīng)用TL-mDC輔以聯(lián)合應(yīng)用小劑量IL-2及IL-12，體外激活自體T

17、細(xì)胞，制備活化的CTL。應(yīng)用淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)共刺激后的T細(xì)胞增殖反應(yīng)；應(yīng)用細(xì)胞毒殺傷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CTL腫瘤特異性殺傷活性；應(yīng)用ELISA測(cè)定CTL上清液中的INF-γ分泌水平。 結(jié)果：TL-mDC體外聯(lián)合輔以小劑量IL-12、IL-2較單純應(yīng)用TL-mDC具有更強(qiáng)刺激自體初始T細(xì)胞增殖的能力；其激活的自體T細(xì)胞上清液中INF-γ的分泌水平顯著高于TL-mDC刺激組(P＜0.05)，兩組活化的T細(xì)胞對(duì)自體胃癌細(xì)胞的殺傷效率存在顯著