探討PRXⅡ在小鼠卵巢中表達(dá)模式及其對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的作用與機(jī)制.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分:PrxⅡmRNA及蛋白在小鼠卵巢中的表達(dá)模式
　　 目的:探討Peroxiredoxin Ⅱ(PrxⅡ)mRNA及蛋白在小鼠卵巢中的表達(dá)模式。
　　 方法:選擇不同發(fā)育時(shí)期C57BL/6J小鼠卵巢，運(yùn)用免疫組化SP染色法、免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot)、半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分別檢測(cè)不同發(fā)育時(shí)期卵巢組織中PrxⅡ蛋白、mRNA的表達(dá)水平。
　　

2、 結(jié)果:PrxⅡ蛋白在各級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞中均有表達(dá)，顆粒細(xì)胞其表達(dá)水平隨卵泡發(fā)育而逐漸增強(qiáng)。始基卵泡與初級(jí)、次級(jí)、竇狀卵泡相比，其卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞中PrxⅡ蛋白表達(dá)水平明顯低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。初級(jí)卵泡分別與次級(jí)、竇狀卵泡相比其顆粒細(xì)胞中PrxⅡ蛋白表達(dá)水平較低，差異具有顯著性(P<0.05)。閉鎖卵泡的PrxⅡ蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，明顯高于生長(zhǎng)卵泡中的表達(dá)水平。黃體及間質(zhì)中亦見(jiàn)少量PrxⅡ的表達(dá)。PrxⅡmRN

3、A在卵巢組織中的表達(dá)水平隨小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)明顯改變。3周，6周，11周小鼠卵巢中PrxⅡmRNA及蛋白表達(dá)水平不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論:PrxⅡ表達(dá)于小鼠各個(gè)年齡階段及卵泡的不同發(fā)育階段，在卵泡發(fā)育后期和閉鎖卵泡中強(qiáng)表達(dá)，提示PrxⅡ在卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育及閉鎖過(guò)程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。
　　 第二部分:PrxⅡ?qū)︻w粒細(xì)胞增殖、凋亡的作用及機(jī)制探討
　　 目的:探討RNAi特異性沉默PRX2基因

4、對(duì)顆粒細(xì)胞增殖、凋亡影響及作用機(jī)制。
　　 方法:采用小片段干擾RNA(siRNA)沉默PRX2基因在顆粒細(xì)胞細(xì)胞中的表達(dá)，沉默效應(yīng)通過(guò)Real-Time PCR和Western Blot驗(yàn)證。MTT比色法、流式細(xì)胞技術(shù)分析PrxⅡ基因表達(dá)下調(diào)對(duì)顆粒細(xì)胞增殖、凋亡的影響及Hoechst 33342試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變。DCF探針檢測(cè)PRX2基因表達(dá)下調(diào)顆粒細(xì)胞過(guò)氧化氫產(chǎn)生。Western Blot檢測(cè)干擾PrxⅡ蛋白表達(dá)后

5、對(duì)NF-κB表達(dá)影響。
　　 結(jié)果:靶向PrxⅡ的siRNA轉(zhuǎn)染48小時(shí)后檢測(cè)效應(yīng)，結(jié)果顯示可有效封閉顆粒細(xì)胞中PrxⅡmRNA與蛋白的表達(dá)，表達(dá)降低至對(duì)照40[％]，封閉使細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫產(chǎn)生增加至正常對(duì)照組2倍，Si-PrxII可抑制細(xì)胞增值，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA的GC凋亡率9[％]、11[％]相比，轉(zhuǎn)染PrxII siRNA 72h后，GC凋亡率增加至35[％]。Si-PrxII亦可減弱顆粒細(xì)胞清除