TGF-β1、TIMP-1、TIMP-2 RNAi質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定.pdf_第1頁(yè)
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1、目的：利用RNA干擾技術(shù)，分別以TGF-β1、TIMP-1和TIMP-2為靶基因，構(gòu)建靶向TGF-β1、TIMP-1和TIMP-2基因的RNA干擾真核表達(dá)載體并進(jìn)行鑒定分析及體外觀察干擾效率。 方法：針對(duì)目的基因TGF-β1、TIMP-1和TIMP-2分別設(shè)計(jì)合成編碼目的基因的反向重復(fù)序列，中間間隔9個(gè)核苷酸序列，經(jīng)退火形成互補(bǔ)雙鏈，通過定向克隆至質(zhì)粒pGenesil-1，構(gòu)建siRNA真核表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌，提取

2、質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析。并體外轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的HSC-T6細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染效率及對(duì)目的基因的抑制效率。 結(jié)果：酶切證實(shí)目的DNA定向克隆至載體上，測(cè)序分析結(jié)果與目的序列相同。熒光顯微鏡下觀察，可見大量帶熒光的細(xì)胞。RT-PCR結(jié)果顯示，六個(gè)特異性的siRNA表達(dá)載體均有抑制效果，其中psi-TGF-B1-1、psi-TIMP1-1、psi-TIMP2-2抑制效率較高。 結(jié)論：成功構(gòu)建了針對(duì)TGF-β1、TIMP-1和TIMP

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