核苷酸焦磷酸酶基因多態(tài)性與脊柱后縱韌帶骨化程度及骨化進展相關的初步研究.pdf

1、后縱韌帶骨化(ossification of posterior longitudinal ligament,OPLL)是一種起源于韌帶組織的異位骨化性病變。1938年,Key第一次描述了頸椎的后縱韌帶骨化可引起脊髓受壓而產生臨床癥狀。其病因至今仍未明了,先后有學者提出了椎間盤變性學說、鈣代謝異常學說、機械損傷學說,等等。至今仍都停留在推測及學說階段。隨著分子生物技術以及基因技術的迅速發(fā)展并應用于醫(yī)學領域,眾多學者希望從分子水平甚或基因

2、水平上找到OPLL的發(fā)病基礎,以及基因變化與病情演變、預后甚至骨化進展的關系,力求從根本上解釋臨床出現(xiàn)的諸多問題。研究發(fā)現(xiàn)核苷酸焦磷酸酶(Nucleotide pyrophosphatase,NPPS)基因多態(tài)性、人類α2膠原(human collagen alpha2(XI),COL11A2)等基因的多態(tài)性在后縱韌帶骨化起始、形成以及骨化程度均有一定程度的影響。 Koga等研究證明OPLL致病基因位于靠近HLA復合體第六號染色

3、體上。為此,Okawa等利用TTW大鼠模型研究發(fā)現(xiàn):TTW大鼠的OPLL表型是由于NPPS基因無意義突變造成的。TTW大鼠具有與人類的后縱韌帶骨化相類似遺傳素質,易于發(fā)生后縱韌帶骨化,常作為研究后縱韌帶骨化的動物模型。NPPS基因編碼核苷酸焦磷酸酶,從而調節(jié)軟組織的鈣化和骨礦物質的沉積。核苷酸焦磷酸酶是無機焦磷酸鹽(PPi)產生的主要作用酶,PPi是機體抑制組織鈣化的主要抑制劑,NPPS功能失常導致PPi水平下降,促進異位組織包括韌帶組

4、織骨化。許多報道提出NPPS基因不同位點突變與脊柱的后縱韌帶骨化易感性、以及骨化程度有一定的相關性。Koshizuka等應用單核苷酸多態(tài)性(SNPs)研究的方法對部分OPLL患者的NPPS基因進行分析,并發(fā)現(xiàn)靠近16號外顯子的15號內含子的14位“T”被“C”替代(IVS15-14T→C),其基因類型突變與OPLL的發(fā)生率以及骨化的嚴重程度密切相關。Tahara提出NPPS基因IVS20-11delT與OPLL的骨化發(fā)生率無明確的相關性

5、,但在OPLL伴有胸椎后縱韌帶骨化患者中有較高的發(fā)生率且有意義。目前國內均未見有關核苷酸焦磷酸酶影響骨化即羥基磷灰石沉積的機制以及微觀上表達、脊柱后縱韌帶骨化程度與NPPS基因多態(tài)性相關性的研究。 近來國外文獻報道：頸椎OPLL手術后病人,尤其是后路術后OPLL有明顯發(fā)展的跡象,且OPLL繼續(xù)進展的比率高達70％左右,少數(shù)患者甚至再次出現(xiàn)明顯的脊髓或神經受壓癥狀。分析其原因,許多學者提出與手術導致后結構破壞,椎管的張力減小、后縱

6、韌帶承受機械應力增加有關系。有研究提出：脊柱韌帶在局部應力變化的環(huán)境下,不但是應力本身造成韌帶纖維等的損傷而出現(xiàn)異常的骨化,應力刺激亦可造成機體的應激反映而出現(xiàn)局部微環(huán)境的變化,即纖維細胞等出現(xiàn)異常的蛋白表達,包括一些能誘導纖維細胞向骨細胞分化的細胞因子,如骨形成蛋白、轉化生長因子β、血管生長因子、胰島素樣生長因子I(ISGF-I)等。上述各因子能刺激骨母細胞DNA合成、毛細血管侵入,使前膠原蛋白合成增加,在OPLL患者的后縱韌帶細胞中

7、選擇性誘導成骨分化,在后縱韌帶細胞上受體數(shù)目增多,進而影響膠原在韌帶骨化不同區(qū)域的表達、骨化進展等病理生理過程。然其發(fā)生機制又是如何?TTW大鼠作為研究后縱韌帶骨化的動物模型,其骨化程度隨鼠齡增長逐漸加重而最終導致大鼠的脊髓直接受壓癱瘓,NPPS基因突變可能與TWY大鼠的骨化進展呈直接相關。人類OPLL進展是否與NPPS基因的某些外顯子或內含子的核苷酸序列的多態(tài)性變異有關?影響骨化進展的相關綜合因素有哪些?目前有關OPLL術后骨化進展與

8、NPPS基因突變之關系國內外未見報道。 目的：綜合分析OPLL患者骨化程度以及骨化術后進展的相關因素,并通過PCR、SNPs等技術分析其NPPS基因多態(tài)性與骨化發(fā)生率、骨化程度以及骨化術后進展的相關性,結合電鏡掃描結果了解核苷酸焦磷酸酶影響羥基磷灰石沉積及骨化的具體機制。從病理免疫組化實驗上了解骨化組織骨化進程及成骨細胞因子與骨化進展的關系。進而更加全面了解OPLL的發(fā)生機制,尤其是骨化程度及骨化進展的情況,為臨床診治尤其是OP

9、LL術后骨化進展患者提供確實可行的實驗證據(jù)。 方法： (1)綜合分析與脊柱后縱韌帶骨化程度相關的因素,收集95例收治的后縱韌帶骨化患者的外周血液和90例的非后縱韌帶骨化患者的外周血液,通過聚合酶鏈反應(PCR)、單核苷酸多態(tài)性(SNPs)方法檢測核苷酸焦磷酸酶基因的四個相關位點的多態(tài)性；并比較分析OPLL患者骨化發(fā)生率、骨化程度與NPPS基因多態(tài)性的相關性,結合電鏡掃描結果了解NPPS基因影響韌帶骨化的機制。 (

10、2)分析獲得隨訪的39例脊柱后縱韌帶骨化術后骨化進展患者的相關資料,測量其骨化進展的相關數(shù)據(jù),分析與OPLL術后骨化進展的相關影響因素,并分析其與NPPS基因的四個突變位點的相關性。 (3)通過對手術獲得的30例頸椎后縱韌帶骨化患者的后縱韌帶骨化標本進行組織病理學和免疫組化試驗,比較分析不同骨化類型其骨化的組織病理學變化情況、骨化的連續(xù)進程具體分區(qū)以及成骨細胞因子在骨化局部分布情況,了解成骨細胞因子與骨化術后進展的相關性。

11、 結果： (1)脊柱后縱韌帶骨化類型與骨化程度即骨化厚度和骨化椎節(jié)數(shù)有一定的相關性,脊柱后縱韌帶骨化程度與頸3后縱韌帶骨化及胸椎后縱韌帶骨化有一定的相關性,故頸3后縱韌帶骨化、胸椎后縱韌帶骨化可作為骨化程度的相對指標。選擇并檢測NPPS基因以下四個基因突變位點:A533C(exon4,533A→C)、IVS15-14T→C(intron15,-14T→C)、C973T(exon9,973C→T)、IVS20-11delT(in

12、tron20,-11 deletion T)。結果表明核苷酸焦磷酸酶基因多態(tài)性與脊柱后縱韌帶骨化的發(fā)生率、骨化程度有一定的相關性。其中骨化的發(fā)生率與NPPS基因IVS15-14T→C位點變化相關性更為密切,而NPPS基因IVS20-11delT位點變化與脊柱后縱韌帶骨化的程度關系相對較為密切。在膠原纖維內可見散在的由纖維細胞轉化而來類軟骨樣細胞以及羥基磷灰石沉積。 (2)影響脊柱后縱韌帶骨化術后進展的影響因素有多方面：手術方式是

13、影響骨化進展的首要因素,前路手術后骨化進展顯著少于后路手術；其次為伴頸3后縱韌帶骨化；患者年齡是第三因素,年輕的連續(xù)型或混合型骨化患者術后骨化進展度相對較高。NPPS基因多態(tài)性與骨化進展有一定的相關性:NPPS基因內含子20上游第11位的T堿基缺失IVS20-11delT(intron20,-11 deletion T)與OPLL術后骨化進展有顯著的相關性,并且與頸3后縱韌帶骨化相關密切,其具體的產生機理尚無法明確,可能與內含子的修飾功

14、能有關。 (3)后縱韌帶骨化病理呈現(xiàn)明顯的連續(xù)進程：可分為骨化區(qū)、鈣化軟骨區(qū)、纖維軟骨區(qū)和纖維區(qū)。連續(xù)型骨化與局限型骨化病理略有不同。骨化標本免疫組化實驗顯示：在骨化進程的各區(qū)域內有關成骨因子如骨形成蛋白2、轉化生長因子β、Ⅰ型Ⅱ型膠原以及血管生長因子的表達重點不同,與骨化發(fā)展過程相關密切。Ⅰ型膠原主要在骨化區(qū)內表達,Ⅱ型膠原及TBFβ主要在鈣化軟骨區(qū)內表達,BMP2主要在纖維軟骨區(qū)內表達,血管生長因子主要在纖維區(qū)及交界處表達。

15、OPLL術后骨化進展與局部細胞因子關系密切,BMP2與TGF-β協(xié)同作用促進骨化進展。OPLL患者手術方式與骨化進展有顯著的相關性。手術方式選擇需綜合考慮患者的年齡、患者術前脊髓神經功能,而骨化局部因素以及有關術后骨化進展的相關因素需綜合考慮。 結論： (1)脊柱OPLL骨化程度與骨化類型、伴頸3后縱韌帶骨化以及胸椎后縱韌帶骨化相關密切；脊柱OPLL的發(fā)生率及程度與NPPS基因多態(tài)性有一定的相關性。 (2)脊柱O