表達弓形蟲SAG1偽狂犬病病毒的構建及免疫研究.pdf

1、弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細胞內寄生原蟲，能引起人獸共患的弓形蟲病。由于弓形蟲生活史復雜，傳播途徑多樣，對弓形蟲的治療，特別是弓形蟲包囊，迄今尚未有理想藥物。因此弓形蟲疫苗已成為弓形蟲病防治研究的重點。 為構建表達弓形蟲SAG1基因的重組偽狂犬病病毒，本研究利用PCR技術擴增弓形蟲主要保護性抗原基因SAG1，將其克隆入真核表達載體pcDNA3.1，將含有SAG1基因的表達盒克隆入偽狂犬病病毒基因缺失轉

2、移載體，經同源重組獲得了表達弓形蟲SAG1基因的重組偽狂犬病病毒。 真核表達載體的構建利用PCR技術擴增出弓形蟲主要保護性抗原基因SAG1，克隆入真核表達載體pcDNA3.1，經酶切鑒定及序列分析，構建真核表達載體pcDNA/SAG1。 重組偽狂犬病毒的構建真核表達載體pcDNA/SAG1經雙酶切獲得SAG1基因表達盒(上游為CMV啟動子，下游為BGH ployA信號)，并將其克隆入偽狂犬病病毒轉移載體p8KD，構建中間

3、轉移載體p8KD/SAG1。利用脂質體轉染方法，將中間轉移載體p8KD/SAG1與偽狂犬病毒rPRV/LacZ基因組共轉染Vero細胞，經藍白斑篩選，獲得攜帶SAG1基因的重組偽狂犬病病毒rPRV/SAG1。 重組偽狂犬病毒的鑒定分別提取重組病毒rPRV/SAG1基因組DNA和總RNA，運用SAG1特異性引物進行PCR及RT-PCR，結果擴增出特異性目的條帶。經Western blot和間接免疫熒光試驗證實，重組病毒表達的SAG

4、1蛋白能被抗弓形蟲的多克隆陽性血清識別。重組病毒rPRV/SAG1的穩(wěn)定性試驗表明，該病毒在體外連續(xù)傳20代，仍能檢測到SAG1的表達，說明rPRV/SAG1具有較好的遺傳穩(wěn)定性。 動物保護性試驗為鑒定rPRV/SAG1的免疫保護效果，以BALB/c小鼠進行了免疫保護性試驗。 結果表明，真核表達載體pcDNA/SAG1及重組病毒rPRV/SAG1能誘導小鼠產生特異性的IgG抗體，產生較高水平的IL-2和IFN-γ；并且p