葡萄胎高表達(dá)的F10基因功能初步研究.pdf

1、葡萄胎是一種與妊娠有關(guān)的良性病變，發(fā)病率為1／100-1／500，部分葡萄胎可發(fā)展為侵蝕性葡萄胎，再進(jìn)一步發(fā)展成絨癌。因此葡萄胎仍是一種嚴(yán)重危害育齡婦女生育健康及身心健康的重要疾病。葡萄胎的發(fā)生與惡性轉(zhuǎn)化機(jī)制仍不明確， 目前有如下幾方面的學(xué)說(shuō)： 1、流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明文化因素和葡萄胎的發(fā)生有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。提示較高的文化程度可以降低葡萄胎發(fā)病的可能性。 2、葡萄胎的遺傳學(xué)說(shuō)：葡萄胎的發(fā)生多是異常受精所致。

2、3、研究結(jié)果顯示妊娠次數(shù)與葡萄胎的發(fā)病也是有相關(guān)關(guān)系，較多的妊娠次數(shù)可能是葡萄胎發(fā)病的一種危險(xiǎn)因素。 4、另外多次接受刮、吸宮術(shù)也是葡萄胎發(fā)生的一項(xiàng)重要危險(xiǎn)因素。 5、癌基因及腫瘤抑制基因和凋亡調(diào)節(jié)基因也參與葡萄胎的發(fā)生。 而目前的大量研究提示葡萄胎的基因組中可能存在遺傳易感基因，迄今為止國(guó)內(nèi)外還未獲得葡萄胎的遺傳易感基因。為明確葡萄胎的基因?qū)W發(fā)病機(jī)制，前期我們從基因克隆方面入手，在早孕的絨毛組織和正常的葡萄胎組

3、織進(jìn)行抑制性消減雜交，分離和鑒定出一種功能未明的在葡萄胎中高表達(dá)的基因F10，F(xiàn)10是一個(gè)新基因從未在任何組織或疾病中有過(guò)研究報(bào)道。 第一部分：F10基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)譜分析 F10基因是我們?cè)谔接懫咸烟グl(fā)病機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn)的未知功能的新基因。 方法： 1、F10低表達(dá)細(xì)胞株的篩選：選取Be17402、HIC、HepG2、PC、A549、MGC、16HBE、293八種細(xì)胞，利用細(xì)胞免疫組化技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)

4、篩選出F10低表達(dá)的細(xì)胞株； 2、F10基因轉(zhuǎn)染其低表達(dá)的細(xì)胞株后觀察其基因表達(dá)譜的變化：利用差異顯示技術(shù)粗篩F10基因?qū)?xì)胞基因表達(dá)譜的影響，實(shí)驗(yàn)分四組：質(zhì)粒pRc-CMV2／F10+、pRc-CMV2、pRc-CMV2／F10-分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞組及空白細(xì)胞對(duì)照組。 結(jié)果： 1、熒光定量PCR、細(xì)胞免疫組化結(jié)果表明：新基因F10在人的8種細(xì)胞中呈不同程度的表達(dá)。其中F10基因在MGC、PC、Be1740

5、2中高表達(dá)，在HepG2、HIC中表達(dá)次之，在293中表達(dá)量較低，在16HBE、A549中表達(dá)量最低。 2、質(zhì)粒pRc-CMV2／F10+、pRc-CMV2、pRc-CMV2／F10-分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞組及空白細(xì)胞對(duì)照組四個(gè)實(shí)驗(yàn)組間差異顯示的條帶擴(kuò)增后測(cè)序獲得 小結(jié)： 1、利用細(xì)胞免疫組化技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)到F10在Be17402、HIC、HepG2、PC、A549、MGC、16HBE、293八種

6、細(xì)胞中呈不同水平的表達(dá)。其中F10基因在MGC、PC、Be17402中高表達(dá)，在HepG2、HIC中表達(dá)次之，在293中表達(dá)量較低，在16HBE、A549中表達(dá)量最低。 2、利用差異顯示技術(shù)粗篩F10基因轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響，獲得的各組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異表達(dá)的5個(gè)基因：annexinI、IPLA2、DATF1、STAT1、BASP1，根據(jù)差異表達(dá)基因的功能提示F10基因參與細(xì)胞的增殖和凋亡過(guò)程。 第二部分：F10

7、基因?qū)D(zhuǎn)錄因子活性影響 我們通過(guò)抑制性消減雜交和差異篩選法，克隆到一個(gè)新的在葡萄胎中表達(dá)上調(diào)的基因片斷：F10ESTcDNA(Genbank登陸號(hào)：AB196290)，利用細(xì)胞免疫組化和熒光定量PCR技術(shù)在Be17402、HIC、Hepc2、PC、A549、MGC、16HBE、293八種細(xì)胞中篩選出F10低表達(dá)的細(xì)胞株后利用差異顯示技術(shù)粗篩F10基因轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響，根據(jù)獲得差異表達(dá)基因的功能，提示F10基因可能與細(xì)胞

8、的增殖和凋亡有關(guān)。 方法： 1、F10基因?qū)χ匾男盘?hào)傳導(dǎo)通路的影響：質(zhì)粒pRc-CMV2／F10+(pRc-CMV2、pRc-CMV2／F10-)和報(bào)道系統(tǒng)AP1-Luc(NF-κB-Luc、pHSE-luc、pCRE-luc、pSRE-luc、pGRE-luc)共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，通過(guò)測(cè)定熒火蟲熒光素酶活性，利用熒光素酶報(bào)道系統(tǒng)分析F10對(duì)細(xì)胞重要傳導(dǎo)通路的作用。 2、EMSA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AP1和NF-κB和DN

9、A的結(jié)合活性。 結(jié)果： 1、pRc-CMV2／F10+組、pRc-CMV2組與pRc-CMV2／F10-組細(xì)胞在F10和API-Luc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染24h即可檢測(cè)熒光素酶的活性，并逐漸增高至轉(zhuǎn)染后48h，pRc-CMV2／F10+組較pRc-CMV2組與pRc-CMV2／F10-組之間的熒光素酶活性高且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.000。pRc-CMV2組與pRc-CMV2／F10-組熒光素酶活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，轉(zhuǎn)染72h后各組

10、熒光素酶活性開始下降，各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2、pRc-CMV2／F10+組、pRc-CMV2組與pRc-CMV2／F10-組細(xì)胞在F10和NF-κB-Luc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染24h即可檢測(cè)熒光素酶的活性，48小時(shí)達(dá)到最高，pRc-CMV2／F10+組較其它二組熒光素酶活性低且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.000。 3、pRc-CMV2／F10+組、pRc-CMV2組與pRc-CMV2／F10一組細(xì)胞在F10分別和pHSE一1uc

11、、pCRE-luc、pSRE-luc、pGRE-luc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后的熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 小結(jié)： 1、利用質(zhì)粒pRc-CMV2／F10+(pRc-CMV2、pRc-CMV2／F10-)分別和報(bào)道系統(tǒng)AP1-Luc共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，通過(guò)測(cè)定熒火蟲熒光素酶活性，利用熒光素酶報(bào)道系統(tǒng)分析F10對(duì)細(xì)胞重要傳導(dǎo)通路的作用。 第三部分：F10基因?qū)?xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響 綜合前二部分的研究，提示F10基

12、因參與促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育異常。 方法： 1、F10對(duì)細(xì)胞增殖的影響：轉(zhuǎn)染pRc-CMV2／F10和pRc-CMV2質(zhì)粒于肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)二組細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況； 2、F10對(duì)細(xì)胞周期的影響：轉(zhuǎn)染pRc-CMV2／F10和pRc-CMV2質(zhì)粒于肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)二組細(xì)胞各個(gè)細(xì)胞周期的變化情況； 3、利用免疫組化方法檢測(cè)上述二組細(xì)胞中增

13、殖核抗原(PCNA)和細(xì)胞周期素D1(cyclinD1)的表達(dá)變化。 結(jié)果： 1、根據(jù)酶標(biāo)儀連續(xù)6天測(cè)定的570nm波長(zhǎng)吸光值繪制出肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)曲線，在保證培養(yǎng)條件、接種細(xì)胞量、觀察時(shí)間一致的情況下，二組細(xì)胞之間總體生長(zhǎng)趨勢(shì)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。pRc-CMV2／F10組其促進(jìn)細(xì)胞增殖作用比對(duì)照組明顯。 2、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果：pRc／CMV2／F10基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞48小時(shí)較對(duì)照組細(xì)胞中G

14、2／M期細(xì)胞比例升高1.2倍、S期升高2.1倍。二組相比差異有顯著性意義，P<0.05。 3、免疫組化顯示：PCNA在A549／F10組細(xì)胞中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在A549／空載體組細(xì)胞中呈中度陽(yáng)性表達(dá)。 小結(jié)： 1、轉(zhuǎn)染pRc-CMV2-F10和pRc-CMV2質(zhì)粒于肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)得出二組細(xì)胞連續(xù)6天的總體生長(zhǎng)趨勢(shì)差異有顯著性意義(P=0.000)。pRc-CMV2／F10+組其促進(jìn)細(xì)胞增殖作用較對(duì)

15、照組明顯。提示F10基因有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。 2、轉(zhuǎn)染pRc-CMV2-F10和pRc-CMV2質(zhì)粒于肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)F10對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響，pRc／cMV2／F10基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞48小時(shí)較對(duì)照組細(xì)胞中G2／M期細(xì)胞比例升高1.2倍，S期升高2.1倍。 3、利用免疫組化方法檢測(cè)細(xì)胞中增殖核抗原(PCNA)和細(xì)胞周期素D1(eyelinD1)的表達(dá)變化。 第四部分：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染F10基因A5

16、49細(xì)胞株的構(gòu)建 研究探討基因的功能利用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)將外源基因轉(zhuǎn)入某一細(xì)胞，通過(guò)觀察細(xì)胞生物學(xué)行為的變化來(lái)認(rèn)識(shí)基因的功能，這是目前使用最廣泛、技術(shù)最成熟的基因功能研究方法，而建立穩(wěn)定表達(dá)外源基因的細(xì)胞模型是這一研究不可或缺的關(guān)鍵一步。 方法： F10基因真核細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建與鑒定： 1.質(zhì)粒pRc-CMV2／F10和pRc／CMV2提取、鑒定后轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞系。用G418篩選并擴(kuò)大培養(yǎng)，建立陽(yáng)性單克

17、隆細(xì)胞株。 2.熒光定量PCR技術(shù)鑒定獲得的陽(yáng)性克隆細(xì)胞株。 結(jié)果： 1.質(zhì)粒pRc-CMV2／F10、pRc-CMV2轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞系后細(xì)胞經(jīng)過(guò)大約三個(gè)月的篩選，得到2株穩(wěn)定表達(dá)pRc／cMV2-F10基因的A549細(xì)胞和1株穩(wěn)定表達(dá)pRc／CMV2基因的A549細(xì)胞。 2.熒光定量PCR結(jié)果表明：pRc-CMV2／F10+細(xì)胞株F10表達(dá)水平較pRc-CMV2高，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P<0.05。