早期肺鱗癌相關蛋白的篩選及其表達驗證.pdf

1、為了篩選、鑒定出早期肺鱗癌相關的蛋白質,以Ⅰ期肺鱗癌組織以及相應的癌旁正常肺組織、I期肺鱗癌患者血清和健康正常人血清為研究對象和材料,聯(lián)合應用比較蛋白質組學方法和血清學蛋白質組分析方法篩選早期肺鱗癌相關蛋白。本研究可豐富人類對肺組織蛋白質組的認識,同時通過相應的鑒定和驗證,期望發(fā)現(xiàn)肺鱗癌中特異性的蛋白質,為肺癌的早期診斷提供依據(jù),也將有助于進一步揭示肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制。研究目的:1.通過優(yōu)化雙向電泳及免疫印跡技術,建立穩(wěn)定的比較蛋白

2、質組學和血清學蛋白質組技術平臺,結合基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(Matrix-assistedlaser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)技術,篩選和鑒定出早期肺鱗癌差異蛋白質。2.通過實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)、Western Blot、免疫組織化學方法檢測肺鱗癌

3、差異蛋白在基因、蛋白水平的表達情況,驗證蛋白質組學方法篩選結果的可靠性和準確性,并結合臨床病理信息進行分析,初步探討其在肺鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的表達變化。材料與方法:1.研究對象:組織標本:收集22例肺鱗癌患者的癌組織及相應的癌旁正常組織,其中Ⅰ期患者6例,Ⅱ期4例,Ⅲ期12例;高分化患者5例,中分化7例、低分化10例。所有肺組織標本均經過組織病理學確診。血清標本:收集12例Ⅰ期肺鱗癌患者及12例正常體檢人群的血清。2.研究方法:2.1蛋白

4、質組學方法篩選、鑒定早期肺鱗癌相關蛋白。2.1.1蛋白樣品的處理分別提取6例Ⅰ期肺鱗癌患者癌組織及癌旁正常肺組織的可溶性總蛋白,Bradford方法測定蛋白樣品濃度,作為分析型和制備型凝膠蛋白上樣量的依據(jù),蛋白樣品應用2-D clean-up kit進行除雜處理。2.1.2比較蛋白質組學分析分別將肺鱗癌組和癌旁正常組標本等質量混合,在優(yōu)化的2-DE條件下,每組混合樣本以分析型蛋白上樣量(11cm pH3～10 IPG膠條)在相同條件下進

5、行3次2-DE,硝酸銀染色后得到肺鱗癌分析型雙向電泳凝膠圖譜,用Imagescanner圖像掃描儀獲取凝膠圖像,采用ImageMaster 2D Platinum 6.0圖像分析軟件對2組的全蛋白質組表達譜進行差異分析,分別以各組中2-DE效果好、點數(shù)多的一塊膠作為參考膠,進行組間的匹配分析。2.1.3血清學蛋白質組分析方法(SESPA)(11cm pH3～10 IPG膠條),2塊凝膠轉膜后分別與肺鱗癌組混合血清及對照組混合血清孵育,經

6、二抗反應和DAB試劑盒顯色后獲取肺鱗癌組織與肺鱗癌患者血清及對照混合血清的Western Blot反應圖譜。經圖像分析軟件及人工比對,找出NC膜上差異反應蛋白點并在平行凝膠上定位。結合比較蛋白質組學方法所獲取的差異蛋白質點圖譜,選擇二者共有的差異蛋白質作為肺鱗癌差異蛋白。2.1.4肺鱗癌相關蛋白的鑒定將比較蛋白質組學和SERPA得到的共有差異蛋白點從制備型凝膠(17cmpH3～10,IPG膠條)上挖下,膠內酶解后,經MALDI-TOF-

7、MS和串聯(lián)質譜(tandemmass spectrometry,TMS)進行分析,獲得肽質量指紋圖譜(Peptide MassFingerprint,PMF)或肽序列標簽(Peptide Sequence Tag,PST),用Mascot軟件搜索蛋白質數(shù)據(jù)庫,聯(lián)合生物信息學,鑒定差異蛋白質性質,作為肺鱗癌相關蛋白的候選標志。2.2肺鱗癌差異蛋白ANXⅠ、HSP27及Ran的表達驗證。2.2.1基因水平的驗證提取肺鱗癌患者癌組織和癌旁正常

8、組織的總RNA,逆轉錄合成cDNA,以β-actin為內參照,采用FQ-PCR方法擴增肺鱗癌相關蛋白ANXⅠ、HSP27及Ran的基因片段,分析轉錄表達情況及其與患者臨床病理特征的關系。2.2.2蛋白表達水平的驗證提取肺鱗癌患者癌組織及其癌旁正常組織的可溶性總蛋白,Bradford法測定樣品的蛋白質濃度。取適量樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,將凝膠上分離的蛋白質轉移至硝酸纖維素(NC)膜上,加入特異性一抗和二抗孵育后ECL顯色,以β

9、-actin為內參照,檢測肺鱗癌相關蛋白的表達情況。2.2.3細胞學定位鱗癌組織及其癌旁正常組織經福爾馬林固定、石蠟包埋,連續(xù)切片。采用過氧化物酶標記的鏈霉卵白素(Streptavidin/Peroxidase,SP)免疫組織化學染色,檢測肺鱗癌相關蛋白ANXⅠ、HSP27及Ran的細胞學定位及其蛋白表達情況。3.統(tǒng)計學處理利用SPSS12.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用t檢驗比較目的基因的表達差異,卡方檢驗比較目的蛋白陽性表達率的差異

10、,以α=0.05為檢驗水準。結果:1.早期肺鱗癌相關蛋白的篩選和鑒定1.1對肺鱗癌組和癌旁正常組織組蛋白混合樣品分別進行3次2-DE,進行組內和組間匹配,建立分辨率及重復性較高的蛋白質表達譜。肺鱗癌組平均匹配蛋白點數(shù)為626個,平均匹配率為87.46％;癌旁正常組平均匹配蛋白點數(shù)為602個,平均匹配率為89.21%。在匹配分析的基礎上篩選出早期肺鱗癌差異蛋白點38個。1.2建立分辨率及重復性較高的肺鱗癌組織蛋白混合樣品與肺鱗癌血清和對照

11、血清的Western Blot圖譜,經軟件分析及人工比對篩選出16個差異反應蛋白點,并在轉膜后的銀染凝膠和平行膠中找到相對應的蛋白質點。結合肺鱗癌組和癌旁對照組組織蛋白混合樣品的差異蛋白質點圖譜,篩選出10個二者共有的差異蛋白質點。1.3在制備膠上挖取相應的差異蛋白點,經MALDI-TOF-MS或TMS進行分析,獲得PMF或PST,搜索NCBInr蛋白質數(shù)據(jù)庫,10個差異蛋白質最終鑒定為膜聯(lián)蛋白Ⅰ(annexinⅠ,ANXⅠ)、熱休克蛋

12、白27(heat shock protein 27,HSP27)、ras相關核蛋白(ras-related nuclear protein,Ran)、Sloo鈣結合蛋白A9(S100 calcin-binding protein A9,S100A9)、鐵蛋白輕鏈(ferritin lightpolypeptide,FLP)、硫氧還原蛋白過氧化物酶3(peroxiredoxin 3,PRX3)、烯酰輔酶A水合酶1(Enoyl Coenzy

13、me A hydratase l,ECH1)、翻譯延伸因子(elongation factor,EF-Tu)、多聚胞嘧啶結合蛋白Ⅰ(poly cR binding proteinⅠ,PCBP1)、PWP1相互作用蛋白4(PWP1-interacting protein 4)。2.肺鱗癌相關蛋白ANXⅠ、HSP27及Ran的表達驗證。2.1ANXⅠ的表達驗證結果熒光定量RT-PCR結果顯示肺鱗癌組織中ANXⅠ基因mRNA的表達水平是癌旁正

14、常組織中的1.81倍,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。低分化肺鱗癌組織中ANXⅠmRNA的表達水平高于高、中分化癌組織,ANXⅠ在早期(Ⅰ期+Ⅱ期)肺鱗癌組織和非早期(Ⅲ期)癌組織中mRNA表達水平的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Western Blot結果表明肺鱗癌組織中ANXⅠ的表達水平明顯高于癌旁正常組織,ANXⅠ在低分化肺鱗癌組織中的蛋白表達水平高于高、中分化癌組織,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

15、ANXⅠ在早期(Ⅰ期+Ⅱ期)肺鱗癌組織和非早期(Ⅲ期)癌組織中蛋白表達水平的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。免疫組化結果顯示ANXⅠ主要定位于胞膜和胞漿,肺鱗癌組織和癌旁正常組織中未發(fā)現(xiàn)陽性定位改變。ANXⅠ在肺鱗癌組織和癌旁正常組織中的總陽性表達率分別為72.73%(16/22)和31.82%(7/22),強陽性表達率分別為40.91%和9.09%。與癌旁正常組織相比,ANXⅠ在肺鱗癌組織中的總陽性表達率和強陽性表達率顯著增高

16、(P<0.05)。Western Blot和免疫組化結果與蛋白質組學結果有相同的差異趨勢。2.2HSP27的表達驗證結果熒光定量RT-PCR結果顯示HSP27在肺鱗癌組織和癌旁正常組織中mRNA的表達水平差異無統(tǒng)計學意義。Western Blot結果顯示HSP27在肺鱗癌組織中蛋白表達水平顯著高于癌旁正常組織(P<0.05),HSP27在低分化肺鱗癌組織中的蛋白表達水平顯著高于高、中分化癌組織(P<0.05)。HSP2

17、7在早期(Ⅰ期+Ⅱ期)肺鱗癌組織和非早期(Ⅲ期)癌組織中的蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。HSP27陽性表達主要定位于細胞胞膜,未發(fā)現(xiàn)肺鱗癌和癌旁正常組織中的陽性定位的變化。HSP27在肺鱗癌組織中的總陽性表達率為72.27%(17/22),強陽性表達率為31.82%(7/22);在癌旁正常組織的總陽性表達率為18.18%(4/22),未發(fā)現(xiàn)強陽性表達。與癌旁正常組織相比較,HSP27在肺鱗癌中的總陽性表達率和強陽性