RNA干擾腫瘤細胞中Raf-1基因表達的實驗研究.pdf

1、目的：應用RNA干擾技術沉默腫瘤細胞中Raf-1基因，通過一系列分子生物學檢驗技術，分析腫瘤細胞生物學行為的變化，探討Raf-1蛋白激酶在不同腫瘤細胞的生長、增殖、分化、凋亡中的作用及機制。 方法：(1)構建三種dsRNA載體pSIREN-shuttle-Raf-1 a,b和c，將構建的載體經脂質體包裹轉染人鼻咽癌細胞株HNEl，人喉癌細胞株Hep-2，人肺癌細胞株A549。(2)進行TUNER染色觀察細胞凋亡，免疫組化染色觀察

2、Raf-1蛋白表達，檢測轉染細胞的細胞凋亡率和Raf-1蛋白的表達水平。(3)采用MTT法對轉染后腫瘤細胞生長曲線進行描繪。(4)采用流式細胞術分析腫瘤細胞在轉染后不同時間段細胞周期的改變。(5)采用流式細胞術檢測轉染后腫瘤細胞凋亡情況。(6)選擇高感染效率載體，進而構建腺病毒載體Adeno-Raf-1b，包裝并擴增(7)用Adeno-Raf-1b進行體外RNA干擾實驗。 結果：(1)pSIREN-shuttle-Raf-1-

3、b在3種腫瘤細胞轉染中抑制Raf-1mRNA和Raf-1蛋白的表達效率較pSIREN-shuttle-Raf-1-a和pSIREN-shuttle-Raf-1-c增高。(2)免疫組織化學結果顯示，Raf-1蛋白在pSIREN-shuttle-Raf-1b轉染的腫瘤細胞中表達率下降，并且表達強度減弱。(3)細胞凋亡檢測pSIREN-shuttle-Raf-1-b表現出較強的促凋亡作用。抑制了3種腫瘤細胞的增殖(P<0.05)。(4)流式細

4、胞術檢測結果顯示， pSIREN-shtlttle-Raf-1-b可以阻止腫瘤細胞由G1期進入S期，轉染后的增殖指數低于未轉染的腫瘤細胞。(5)流式細胞檢測凋亡結果顯示，pSIREN-shuttle-Raf-l-b可以誘導腫瘤細胞出現較明顯的凋亡。(6)腺病毒載體Adeno-Raf-l-b體外干擾A549腫瘤細胞較空病毒載體有促進凋亡發(fā)生的效應。(7)使A549細胞發(fā)生G1期阻滯特有的細胞周期改變。 結論：Raf-l蛋白對腫瘤