靶向蛋白激酶Aurora A的抗腫瘤藥物篩選模型的建立和評價.pdf

1、蛋白激酶是一類能夠將下游底物磷酸化的蛋白，可分為絲/蘇氨酸蛋白激酶和酪氨酸蛋白激酶。蛋白磷酸化作用在細胞內信號傳導過程中發(fā)揮著重要的作用。其作為關鍵的調節(jié)因素在腫瘤形成的各個方面，如增殖、侵入、轉移、血管新生等，都發(fā)揮重要的作用。隨著腫瘤細胞信號傳導途徑的揭示，一些在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用的蛋白激酶已經(jīng)成為篩選抗腫瘤藥物的重要靶點，蛋白激酶抑制劑也成為近年來抗腫瘤藥物開發(fā)研究的熱點，已經(jīng)有一些蛋白激酶抑制劑投放市場，還有數(shù)目眾多的蛋白

2、激酶抑制劑處于臨床前和臨床研究階段。 Aurora A是絲/蘇氨酸蛋白激酶Aurora家族成員之一，其定位于中心體和紡錘體附近，在細胞有絲分裂中主要負責調節(jié)中心體成熟、紡錘體組裝，促進有絲分裂啟動以及促進核膜破裂。Aurora A在多種腫瘤組織中均高表達，其高表達會導致基因的不穩(wěn)定和腫瘤的發(fā)生，同時與某些腫瘤的預后相關。近年來，Aurora激酶抑制劑作為抗腫瘤候選藥物受到廣泛的關注，已有一些處于臨床研究中，且表現(xiàn)出良好的抗腫瘤

3、活性。 本論文研究的目的是擬在分子水平和細胞水平建立蛋白激酶抑制劑的篩選模型，可用于后續(xù)抗腫瘤藥物的篩選工作。 一方面，在分子水平體外利用昆蟲桿狀病毒表達體系表達Aurora A蛋白激酶，用Ni-NTA柱對表達的蛋白進行純化。再用考馬斯亮藍染色和Western blot方法對表達的重組蛋白進行鑒定。結果表明：得到了Aurora A的重組蛋白。基于熒光偏振的方法，摸索各種重要因素酶用量、ATP和底物的條件，確定了相應的濃度

4、。同時用陽性化合物Aurora kinase inbibitor II對模型進行評價，在分子水平成功建立了蛋白激酶Aurora A的抑制劑篩選模型。 另一方面，在細胞水平，利用逆轉錄病毒載體pMSCV包裝病毒，進而感染宿主細胞HEK293，得到穩(wěn)定的Aurora A高表達細胞株，應用RT-PCR和Westernblot方法，從基因水平和蛋白水平對高表達細胞株進行鑒定。結果證明高表達細胞株構建成功，可用于對分子水平篩選得到的化合物