嬰兒型GM1神經節(jié)苷脂貯積癥GLB1基因突變檢測和GLB1-Exon2 GST融合蛋白的表達.pdf

1、研究背景和目的：
　　 GM1神經節(jié)苷脂貯積癥是一種由于溶酶體中酸性β-半乳糖苷酶缺乏所致的常染色體隱性遺傳的鞘脂類儲積病。β-半乳糖苷酶的主要作用是水解神經節(jié)苷脂、糖蛋白和糖胺殘基的β-半乳糖。β-半乳糖苷酶基因的突變可導致該酶的缺失或減少,由此β-半乳糖苷酶的缺乏可以引起多種代謝儲積疾病。GM1神經節(jié)苷脂貯積癥的臨床表現為GM1神經節(jié)苷脂和相關糖復合物在不同的組織,尤其是在中樞神經系統中的儲積,因此除了肝脾腫大、骨骼發(fā)育不全

2、、面部粗糙等臨床特征外,中樞神經系統的受累更為典型,幾乎出現在所有患者的臨床表型中。
　　 根據該疾病發(fā)病時間和臨床癥狀嚴重程度的不同,GM1神經節(jié)苷脂貯積癥被分為嬰兒型、少年型和成年型三種類型,每種類型的癥狀表型存在很大差別,這主要是由于患者體內β-半乳糖苷酶的活性不同造成的,其癥狀嚴重程度與β-半乳糖苷酶的殘余活性呈負相關,其中以嬰兒型患者癥狀最為嚴重,且病情發(fā)展最為迅速。該疾病做為一種罕見的溶酶體貯積癥,其發(fā)病率在活產嬰兒

3、中約為1/100,000-200,0000,但不同地區(qū)和種族間存在著明顯的差異,在某些人群中存在著較高的發(fā)病率,如羅馬人群中的發(fā)病率高達1:10,000,國內對于該疾病的研究較少,發(fā)病情況尚不明確。
　　 人類β-半乳糖苷酶基因(GLB1)位于染色體3p21.33,包含16個外顯子,橫跨將近62.5Kb。該基因上的突變是導致β-半乳糖苷酶缺乏或活性喪失的直接原因,目前已發(fā)現該基因上存在上百種突變,除可導致GM1神經節(jié)苷脂貯積癥外

4、還可引起其他多種疾病。本研究對一例嬰兒型GM1神經節(jié)苷脂患者進行了遺傳學分析。為發(fā)現該基因上可能存在的突變,我們對β-半乳糖苷酶基因各外顯子進行測序分析,并在此基礎上預測發(fā)現的突變對蛋白結構和功能可能造成的影響。GLB1基因第2外顯子多肽鏈較保守且具有相對獨立結構域,因此本研究構建此區(qū)域表達載體,后期可得到能同時識別正常蛋白和突變蛋白的β-半乳糖苷酶抗體,在臨床上可用于對該家族中其他成員就此插入突變進行檢測。
　　 材料和方法：

5、
　　 1.研究對象
　　 一例經臨床診斷為GM1神經節(jié)苷脂貯積癥的患者,其中樞神經系統嚴重惡化,并伴隨骨骼畸形,肝脾腫大等典型GM1神經節(jié)苷脂貯積癥癥狀。患者父母雙方均健康,非近親婚配,均無異常家族史,也納入檢測范圍;正常對照樣本選自隨機健康人群。患者和正常對照均獲得該遺傳分析研究的知情同意權。
　　 2.研究方法：
　　 2.1β-半乳糖苷酶基因16個外顯子序列的PCR擴增和測序分析
　　 取

6、研究對象外周靜脈血5mL加EDTA抗凝,用常規(guī)的酚/氯仿法提取DNA,紫外分光光度計測其濃度。設計合成引物,PCR擴增基因組DNA中β-半乳糖苷酶基因(GLB1)的各個外顯子,然后直接進行測序分析,尋找突變位點。
　　 2.2基于同源建模服務器SWISS-MODEL的蛋白質三維結構預測
　　 在SWISS-MODEL服務器上構建突變蛋白和正常蛋白的三維結構模型,并比較兩者的差異,從而預測突變對整個蛋白的結構和功能的影響。

7、
　　 2.3β-半乳糖苷酶第2外顯子表達載體的構建和GST融合蛋白的表達
　　 人類β-半乳糖酶基因(GLB1)第2外顯子經克隆后連入PGEX-5X-1表達載體,然后轉化入大腸桿菌DH5α,IPTG誘導表達含該外顯子的GST融合蛋白,之后采用SDS-PAGE方法檢測該融合蛋白GLB1-Exon2-GST的表達情況。
　　 結果：
　　 1.第10外顯子上新插入突變c.1019_1020 ins AGGC

8、的發(fā)現通過測序比對得到第10外顯子上一個AGGC四堿基的插入突變,該突變國內外均未見報道,突變造成下游開放閱讀框的改變,在第17位堿基處形成一個終止密碼子。
　　 2.突變蛋白同源模型的構建由建模得到的突變蛋白和正常蛋白的三維結構模型分析得出該突變對原蛋白結構造成巨大影響,體現在氨基酸殘基超過1/3的缺失和突變蛋白自身所含氨基酸殘基相對空間位置的變化,這直接導致了β-半乳糖苷酶酶活性的喪失。
　　 3.GLB1-Exon

9、2 GST融合蛋白的表達通過基因工程手段,我們成功構建了GLB1-Exon2的PGEX-5X-1重組表達載體,之后順利轉化入大腸桿菌DH5α菌株,并通過SDS-PAGE檢測確定融合蛋白GLB1-Exon2-GST的正確表達。
　　 結論：
　　 1.GM1患者GLB1基因第10外顯子上新發(fā)現的c.1019_1020 ins AGGC插入突變引起原蛋白分子量的顯著降低且分子空間結構發(fā)生巨大變化,從而導致β-半乳糖苷酶活性的