CARASIL家系HTRA1突變基因與血管平滑肌細(xì)胞TGF-B信號(hào)通路的關(guān)系研究.pdf

1、伴有皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)病變的常染色體隱性遺傳性腦動(dòng)脈病(cerebralautosomalrecessivearteriopathywithsubcorticalinfarctsandleucoencephalopathy，CARASIL)是一種隱性遺傳性腦血管病，以青年早發(fā)的癡呆、卒中、腰痛、禿頂為主要臨床表現(xiàn)；頭顱影像學(xué)檢查表現(xiàn)為皮質(zhì)下白質(zhì)廣泛的脫髓鞘改變伴有多發(fā)腔隙性腦梗死；腦部尸檢觀察到腦部小動(dòng)脈內(nèi)膜增厚、內(nèi)彈力層斷裂、中膜平滑肌

2、細(xì)胞減少、玻璃樣變及管腔向心性狹窄等類似小動(dòng)脈硬化的表現(xiàn)。半數(shù)以上病例有父母近親結(jié)婚的家族史。整個(gè)病程平均10年。自1965年日本就有病例首報(bào)，但由于對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)不足以及診斷手段的不完善，此后僅有陸續(xù)報(bào)道，包括幾個(gè)家系和一些散發(fā)病例。目前僅有50余例報(bào)道，大部分來自日本。2009年日本學(xué)者匯總了5個(gè)家系，通過基因連鎖分析的方法將該病的致病基因定位于10號(hào)染色體的HTRA1基因。該基因有9個(gè)外顯子，目前報(bào)道的突變位點(diǎn)包括4個(gè)錯(cuò)義突變，2個(gè)

3、無義突變，它們分布在第3、4、6外顯子上。這一區(qū)域位于HtrA1絲氨酸蛋白酶的活性區(qū)，所以往往會(huì)導(dǎo)致酶活性改變。但關(guān)于這方面的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)論十分缺乏。HtrA1絲氨酸蛋白酶在體內(nèi)廣泛存在并且作用于多種靶蛋白，大部分為細(xì)胞外基質(zhì)成分，與人類骨性關(guān)節(jié)炎、腫瘤等疾病有關(guān)。與HTRA1基因有關(guān)的信號(hào)通路為TGF-β/Smads，HtrA1絲氨酸蛋白酶能夠抑制該信號(hào)通路，而基因突變則使蛋白酶活性減低，TGF-β/Smads信號(hào)通路表達(dá)上調(diào)，包括TG

4、F-β1、BMP-2、BMP-4蛋白，從而通過不同途徑導(dǎo)致CARASIL腦小動(dòng)脈的病變和神經(jīng)系統(tǒng)以外的癥狀。
　　 由于病理上能夠見到比較明顯的動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞的大量丟失，所以研究血管平滑肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能變化對(duì)于進(jìn)一步探討CARASIL的發(fā)病機(jī)制尤為重要。目前國(guó)內(nèi)外尚無HTRA1基因轉(zhuǎn)染平滑肌細(xì)胞的相關(guān)研究。2007年我們?cè)趪?guó)內(nèi)首次臨床報(bào)道了一CARASIL家系，本課題旨在研究這一家系HTRA1基因突變方式，并建立一個(gè)HTR

5、A1野生型及突變型基因的平滑肌細(xì)胞表達(dá)模型，檢測(cè)TGF-β1/Smads信號(hào)通路分子的變化，有助于進(jìn)一步理解CARASIL血管病變的病理機(jī)制。
　　 第一部分，CARASIL一家系的臨床、病理和基因分析
　　 研究目的：探討一個(gè)CARASIL家系的臨床病理特征，并對(duì)致病基因進(jìn)行分析。
　　 研究方法：描述2例患者的臨床、影像及病理特征，對(duì)第19號(hào)染色體NOTCH3基因的1-33外顯子全段測(cè)序，第10號(hào)染色體HTR

6、A1基因9個(gè)外顯子測(cè)序。同時(shí)設(shè)正常人群對(duì)照進(jìn)行HTRA1基因檢測(cè)。
　　 結(jié)果：該家系包括2例患者，系同胞姐弟，父母近親結(jié)婚。兩例患者的發(fā)病年齡20-25歲，腦電圖呈彌漫性慢波表現(xiàn)，頭顱MRI檢查均顯示雙側(cè)大腦半球彌漫性白質(zhì)病變，伴有皮質(zhì)下多發(fā)性梗死。腓腸神經(jīng)活檢可見小動(dòng)脈內(nèi)彈力層輕度分裂、中層肥厚、血管腔呈向心性狹窄，PAS染色未見顆粒狀沉積物，淀粉染色陰性，電鏡下在小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞層沒有發(fā)現(xiàn)嗜鋨顆粒。對(duì)第19號(hào)染色體NOTC

7、H3基因的1-33外顯子全段測(cè)序未觀察到突變。對(duì)HTRA1基因第1-9外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)第6外顯子1091T＞C純合錯(cuò)義突變(L364P)，患者父母及患者1的女兒為該位點(diǎn)的雜合突變。對(duì)40例對(duì)照進(jìn)行HTRA1基因的測(cè)序未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)突變或多態(tài)性改變。
　　 結(jié)論：我們對(duì)國(guó)內(nèi)第一個(gè)CARASIL家系從基因水平進(jìn)行了診斷，在HTRA1基因的第6外顯子發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的突變位點(diǎn)。
　　 第二部分，HTRA1基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染血管平滑肌細(xì)

8、胞模型的建立
　　 研究目的：構(gòu)建針對(duì)HTRA1基因的pEGFP-N1載體以及1091T＞C突變質(zhì)粒載體，并將兩種質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染到血管平滑肌細(xì)胞。
　　 研究方法：根據(jù)人HTRA1基因CDS區(qū)的序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，上游：5’-CTCAAGCTTCGAATTCATGCAGATCCCGCGCGCCGCTCTTC-3’；下游：5’-GGCGACCGGTGGATCCCGTGGGTCAATTTCTTCGGGAA-3’。PCR擴(kuò)增目的基

9、因，將目的片段與p-EGFP-N1載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抽提質(zhì)粒后用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后瓊脂糖電泳及質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證，此為野生型質(zhì)粒載體(WT)。另一試驗(yàn)組根據(jù)我們發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)1091T＞C，設(shè)計(jì)兩條包含有突變位點(diǎn)的中間引物，應(yīng)用基因定點(diǎn)突變?cè)頂U(kuò)增含有突變位點(diǎn)的兩段PCR產(chǎn)物，并將產(chǎn)物與pEGFP-N1載體進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建突變質(zhì)粒載體(L364P)。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切及測(cè)序鑒定。用SMCM培養(yǎng)

10、基培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞，用α-SM-actin抗體免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定細(xì)胞。將VSMC隨機(jī)分為三組，分別應(yīng)用DNAfect轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染：(1)WT組：轉(zhuǎn)染HTRA1-pEGFP-N1野生型質(zhì)粒；(2)L364P組：轉(zhuǎn)染HTRA1-pEGFP-N1突變型質(zhì)粒；(3)空白對(duì)照組：轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后使用流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染效率。
　　 結(jié)果：(1)野生型及突變型質(zhì)粒OD值在1.8-2.0之間，濃度300-400ng/ul，雙

11、酶切后可見兩個(gè)條帶存在，分別為4.Tkbp和1400bp，符合pEGFP-N1載體和HTRA1基因的長(zhǎng)度。最后測(cè)序鑒定正確。(2)培養(yǎng)的細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，三角形、條帶型、星型等多種形態(tài)，生長(zhǎng)密集時(shí)稱典型的“峰-谷”狀，單克隆α-SM-actin抗體鑒定結(jié)果陽(yáng)性，證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)之內(nèi)觀察，三組細(xì)胞均有綠色熒光表達(dá)，表明已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染。流式檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率在33％。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建HTRA1基因的野生型

12、和突變型質(zhì)粒載體。兩種質(zhì)粒載體采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞，有效的建立起HTRA1突變基因血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)模型。
　　 第三部分，HTRA1基因在血管平滑肌細(xì)胞的表達(dá)
　　 研究目的：檢測(cè)HTRA1野生型及突變型基因轉(zhuǎn)染血管平滑肌細(xì)胞后的HTRA1mRNA及HtrA1蛋白的表達(dá)。
　　 研究方法：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集對(duì)照組、WT組、L364P組的細(xì)胞，提取總RNA及總蛋白，分別用熒光定量PCR及W

13、esternblot方法檢測(cè)HTRA1基因的表達(dá)。
　　 結(jié)果：三組細(xì)胞內(nèi)均能檢測(cè)到HTRA1基因的表達(dá)。RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HTRA1mRNA在L364P組和WT組表達(dá)增強(qiáng)，與WT組相比，L364P組表達(dá)減少；Westernblot結(jié)果顯示兩個(gè)轉(zhuǎn)染組的HtrA1蛋白比對(duì)照組表達(dá)增多，與WT組相比，L364P組表達(dá)減少。
　　 結(jié)論：HTRA1基因轉(zhuǎn)染血管平滑肌細(xì)胞后能在細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)。1091T＞C突變

14、后導(dǎo)致HTRA1基因mRNA以及HtrA1蛋白減少。
　　 第四部分，HTRA1基因?qū)ρ芷交〖?xì)胞TGF-β1/Smads信號(hào)通路的影響
　　 研究目的：檢測(cè)HTRA1野生型及突變型基因轉(zhuǎn)染血管平滑肌細(xì)胞后的TGF-β1/Smads信號(hào)通路的變化。
　　 研究方法：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集對(duì)照組、WT組、L364P組三組細(xì)胞，提取總RNA及總蛋白，分別用熒光定量PCR及Westernblot方法檢測(cè)TGF-β1

15、、Smad2/3/4及磷酸化Smad2/3的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果：熒光定量PCR結(jié)果顯示，與WT組相比，L364P組中的TGF-β1及Smad2/3的mRNA表達(dá)比WT組增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，smad4的表達(dá)兩組差別不明顯；WB結(jié)果顯示Smad2/3蛋白的表達(dá)L364P組較WT組有所增加，磷酸化的Smad2/3僅在L364P組檢測(cè)到。Smad4的蛋白表達(dá)L364P組較WT組略有減少，差別不明顯。