骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)、凍存及體外誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞分化的研究.pdf

1、哺乳動物的骨髓中含大量成體干細胞，而且取材方便，成為成體干細胞研究焦點。
　　 骨髓間充質(zhì)干細胞（Marrow mesenchymal stem cells，MSCs）是繼造血干細胞（Hematopoietic stem cell，HSCs）之后近年來研究較多的一種骨髓源多能干細胞。MSCs不僅具有強大的增殖分化能力，易于在體外大量繁殖，誘導(dǎo)分化，而且具有向胞外分泌多種細胞因子的特性，參與細胞微環(huán)境的構(gòu)建。體內(nèi)移植具有低免疫原性

2、，在器官移植、自身免疫性疾病及替代治療中有廣闊的應(yīng)用前景。
　　 本文以SD(sprague-dawley)大鼠為實驗材料，首先探討了MSCs的體外分離、擴增的方法。取SD大鼠雙側(cè)股骨、脛骨，采用全骨髓法貼壁培養(yǎng)MSCs，以梯度密度接種骨髓細胞。研究結(jié)果顯示，以0.5～1×107個/mL接種骨髓細胞可以有效縮短原代培養(yǎng)的時間，傳代細胞生長狀態(tài)穩(wěn)定，P2、P4、P6代生長曲線基本相同。免疫熒光法鑒定表面抗原CD29、CD44陽性表

3、達，不表達造血細胞系表面抗原CD34+。免疫熒光雙標鑒定P3代細胞的純度，其CD29陽性率為97.96±0.35％，CD44陽性表達率為98.14±0.19％。
　　 上述結(jié)果充分證明本方法適于在體外快速獲得大量具有較高生物學活性的高純度MSCs。
　　 在此基礎(chǔ)上，對MSCs低溫凍存進行了研究。以MSCs基本培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO為主要成分，設(shè)計不同配比的凍存保護液。以純化的MSCs（P3），1×106個/mL密度

4、，-80℃凍存7d后復(fù)蘇，臺盼藍據(jù)染法檢測復(fù)蘇率，結(jié)果顯示以80％DMEM+10％FBS+10％DMSO作為凍存保護液，復(fù)蘇率為61.00±3.61％，顯著優(yōu)于其余各組。復(fù)蘇后的細胞能夠在體外增殖，并正常傳代。依此方法凍存P4代MSCs，于凍存1、3、6個月后復(fù)蘇，復(fù)蘇率分別為61.67±4.41％、61.67±3.33％和65.00±11.54％，差異不顯著（P>0.05），復(fù)蘇后細胞增殖、傳代正常。對復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)的MSCs行免疫熒

5、光鑒定，其表面抗原CD29與CD44陽性表達，說明凍存后的MSCs仍可保持原有的生物學活性。
　　 此外，本實驗還對MSCs旁分泌作用對NSCs分化的影響進行了研究。以出生24h的SD大鼠乳鼠作為供體，分離、培養(yǎng)海馬源性NSCs，并誘導(dǎo)其分化；以免疫熒光法檢測NSCs 表面抗原Nestin，神經(jīng)元表面抗原NSE 及星形膠質(zhì)細胞表面抗原GFAP。研究結(jié)果表明，以無血清培養(yǎng)的方法聯(lián)合應(yīng)用堿性成纖維細胞生長因子和表皮生長因可以使體外培

6、養(yǎng)的NSCs表現(xiàn)出良好的持續(xù)增殖能力，并且能夠穩(wěn)定地傳代擴增，且傳代后的NSCs表達Nestin陽性。在去除培養(yǎng)液中的生長因子并添加10％ FBS后，NSCs能夠分化成為NSE陽性表達的神經(jīng)元和GFAP陽性表達的星形膠質(zhì)細胞。在建立NSCs 培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)之上，以MSCs條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)NSCs分化，并以上述添加FBS的培養(yǎng)液作為對照，7d后行免疫熒光雙標鑒定，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，MSCs 培養(yǎng)液對NSCs 向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞分化具有促