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文檔簡介
1、本文從以下幾部分進行了論述。
第一部分 血小板裂解液對無血清培養(yǎng)基中脂肪來源干細胞增殖的影響
目的:研究血小板裂解液替代胎牛血清對脂肪來源干細胞(ADSC)分離、增殖、免疫表型的影響,為臨床個體化應用PL進行損傷修復提供實驗依據。
方法:根據二次離心法制作血小板血漿(PRP),然后通過凍融法制作血小板裂解液(PL)。進行ADSC的分離、培養(yǎng),測定其免疫表型,使用CCK-8法測定10%PL組培養(yǎng)、5%PL組培
2、養(yǎng)、10%FBS組培養(yǎng)對細胞增殖活性的影響。
結果:對大鼠血液的二次離心法可以制備出六倍于基礎血小板濃度的PRP,在對大鼠ADSC進行培養(yǎng)時,其免疫表型沒有發(fā)生突變,CCK-8結論為10%PL在培養(yǎng)4天時ADSC增殖活性顯著高于10%FBS,
結論:PL用于培養(yǎng)ADSC時安全性好,可以在無血清培養(yǎng)基中應用;10%PL培養(yǎng)ADSC時,具有顯著促進增殖的優(yōu)點,而ADSC的免疫表型沒有因為PL的存在而發(fā)現突變。
3、第二部分 血小板裂解液對脂肪來源干細胞遷移及成軟骨分化的影響
目的:評估血小板裂解液對ADSC遷移的影響,驗證PL在體外對ADSC的募集作用。研究PL在ADSC成軟骨分化時的作用,為將來體內應用ADSC促進腱骨愈合提供實驗室依據。
方法:使用Transwell法對各種濃度的PL進行遷移實驗,10%FBS作為對照組,然后分三組:空白對照組,TGFB3組,PL+TGFB3組分別進行ADSC的成軟骨誘導培養(yǎng)。使用阿里新藍染
4、色測定檢測細胞分泌的蛋白聚糖含量,同時行 II型膠原免疫熒光檢測確定其表達,在各個時間段行qPCR檢測II型膠原mRNA表達,在4w時行OCN的mRNA表達。
結果:在48h后,可見各濃度PL組有數量不一的ADSC附著與Transwell纖維膜,5%PL組細胞遷移能力顯著大于其它各組。成軟骨誘導后阿里新藍染色見PL+TGFB3組和TGFB3組均勻藍染,II型膠原免疫組化提示2w及3w時對照組無染色,而TGFB3組在2w及3w時
5、均有II型膠原染色,PL+TGFB3組在2w和3w時染色豐富。qPCR檢測提示對照組與TGFB3或者TGFB3+5%PL相比,mRNA表達量要小,2w,3w,4w的P值小于0.001,有統計學差異。TGFB誘導與TGFB3+5%PL誘導,2w時P<0.05,3w時P<0.001,4w時P<0.01,均有統計學差異,后者mRNA表達量大于TGFB3誘導組。OCN的mRNA無統計學差異。
結論:PL對ADSC的促進遷移作用有濃度依
6、賴,5%PL對ADSC具有較強的促遷移作用,特定環(huán)境下能促進軟骨定向分化,其作用優(yōu)于單純使用 TGFB3,且不會發(fā)生成骨分化。
第三部分 血小板裂解液復合脂肪來源干細胞對大鼠跟腱腱骨愈合界面的影響
目的:探討5%PL復合 ADSC對腱骨結合處的愈合影響,觀察其是否能促進纖維軟骨形成,從而從組織學以及生物力學方面改善腱骨愈合質量。
方法:建立大鼠跟腱腱骨愈合模型,清理跟腱止點后分三組,假手術組(G1), AD
7、SC組(G2),ADSC+%PL組(G3),分別進行治療。然后使用HE染色、Masson染色以及阿利新藍染色進行組織學觀察,在2w、4w、6w時分別提取腱骨組織,進行qPCR檢測II型膠原含量。并在2w、4w、6w時測定生物力學變化。
結果:HE染色見G1組6w時止點處為Sharpy纖維,而G2組6w時形成潮線, G3組4w時有潮線形成,6w時可見典型四層結構止點。Masson染色見6w時G1組纖維組織疏松紊亂,膠原纖維波浪樣
8、,雜亂排列。G2組纖維組織排列較好,膠原纖維邊界清晰。而G3組膠原纖維整齊排列,鈣化軟骨與纖維軟骨結合緊密。行阿利新藍染色,G1組6w可見止點愈合,軟骨細胞周圍有藍染,鈣化軟骨處有鈣質沉積, G2組可見軟骨周圍藍染較多,軟骨細胞橢圓形,而G3組軟骨細胞周圍藍染較深,說明蛋白聚糖含量豐富。各圖像藍染值統計學分析示G3顯著高于其它兩組。qPCR檢測在各時間段,G1組II型膠原mRNA表達量均顯著小于G2組和G3組,在2w時G2組II型膠原m
9、RNA表達量與G3組相似,但是4w和6w時均顯著小于G3組。生物力學檢測2w時G1組的最大拉力載荷最低,與正常腱骨組織相比有顯著性差異,而同時G2組和G3組比G1顯著增加。但此時G2組和G3組的最大拉力載荷與正常腱骨組織相比均顯著下降。各組的最大拉力載荷隨時間而增加。6w時G2和G3組的最大拉力載荷顯著大于G1。同時在6w時,G3組的最大拉力載荷顯著大于正常腱骨組織。
結論:PL復合ADSC時,促進ADSC向軟骨細胞分化,同時
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