局部Ad-miR-126基因治療促進小鼠缺血后肢血管新生作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　組織移植是整形外科臨床上最常用的治療手段,臨床實踐中往往較厚的組織,以及體積較大的組織,因為不能在耐缺血時間內,及時、有效的重建血液循環(huán)而不易成活,這仍是整形外科目前在臨床廣泛應用中面臨的巨大難題。因此移植術后能否及時、有效的重建血運是提高移植組織成活率和成活質量的關鍵。而實現(xiàn)這一目的的重要途徑就是及時、高效的促進缺血局部血管新生。血管新生目前認為血管新生主要通過血管形成(angiogenesis)、血管生成(va

2、sculogenesis)以及動脈形成(arteriogenesis)三種機制作用的結果。在缺血病變中,如何能有效的促進血管新生?既往的無論是從各種生長因子,還是從血管前體細胞及干細胞在血管新生中的研究,都只是局限于超過機體生理量的增加這些對于血管新生有關的因子水平,研究中出現(xiàn)各種副作用,比如水腫、腫瘤等,雖取得一些成就,但所存在的各種問題,仍是其在臨床廣泛應用的瓶頸。這也使一些學者改變思路,是否可以從血管新生相關的信號通路入手?

3、>　　近年來隨著研究的不斷深入與拓寬,microRNA(miRNA)逐漸引起人們的注意。miRNA具有組織特異性及細胞特異性,其中內皮細胞特異性高表達miRNA-126(miR-126)在血管新生中具有舉足輕重的作用,通過下調抑制血管生成信號通路的胞內抑制蛋白(spred-1和PIK3R2/p85β)的表達,從而促進血管新生,這給調節(jié)血管新生提供了一種新的思路,從基因水平對其進行調控有可能是解決這個問題的新突破。
　　對于miR-

4、126在血管新生方面的研究,目前仍處于初期探索階段,尤其是對于在活體缺血組織中miR-126水平的表達情況,是否可以通過人為地改變miR-126水平,來促進活體缺血組織的血管新生,以及促進缺血組織血管新生作用可能的信號通路?目前還尚無報道。
　　實驗目的：
　　本課題旨在通過體外擴增、合成、克隆mus-mir-126,重組腺病毒包裝、純化以及滴度測定。局部注射于小鼠的缺血后肢模型,觀察其局部表達情況的變化,以及促血管新生的作

5、用。通過檢測miR-126作用通路中各種因子的表達水平,來探究、證實miR-126具有明顯的促缺血組織血管新生作用,并初探其作用機制。使miR-126基因治療在臨床上應用成為可能。
　　實驗方法：
　　根據(jù)mus-mir-126的基因信息,設計上下游引物,用小鼠基因組DNA為模板擴增mus-mir-126基因;全基因合成mus-mir-126基因至PES載體上;小鼠mus-mir-126基因克隆至pacAd5CMV-IRES

6、-GFP載體上;質粒擴增及線性化;重組腺病毒的包裝;重組腺病毒的大量擴增和滴度測定。C57小鼠隨機分為A組(C57左側缺血后肢手術組)、B組(空病毒C57左側缺血后肢手術組)、C組(重組腺病毒miR-126C57左側缺血后肢手術組)、假手術組(正常小鼠組)四組。借助顯微外科器械建立C57小鼠左后肢缺血模型,術后即刻將滴度為1×109(PFU/mL)重組腺病毒miR-126和腺病毒各50μl局部注射于小鼠缺血左后肢腓腸肌。術后對小鼠大體狀

7、況緊密觀察,并在3、7、14天各組(6只)分別對小鼠腓腸肌取樣,做HE染色,免疫組化CD31、a-SMA染色,實時定量PCR檢測miR-126水平以及Western-blot對ERK1/2、pERK1/2、AKT和pAKT蛋白水平的檢測。整理、統(tǒng)計數(shù)據(jù)。
　　實驗結果：
　　通過體外構建Ad-mir-126測序結果正確(見附錄),質粒鑒定結果(見正文)正確,病毒的PFU滴度達2.00×109(PFU/mL)。通過局部注射于小

8、鼠的缺血腓腸肌中后,觀察到HE染色、CD31、α-SMA免疫組化染色檢測結果一致,均顯示C組較A、B兩組血管內皮細胞增生明顯,新生血管數(shù)目計數(shù)明顯增多。實時定量PCR檢測顯示A組第3天miR-126表達水平明顯降低,此后呈逐漸增高的趨勢,直至第14天還未及正常水平。而C組第3天miR-126表達水平高于正常水平,至第7天達最高水平,然后逐漸降低,至第14天時仍高于正常水平。Western-blot檢測結果顯示C組較A、B組VEGF、bF

9、GF等介導的IP3和MAPK信號通路中pERK1和pAKT活化水平增高。
　　結論：
　　體外構建重組腺病毒mir-126,測序結果正確,質粒鑒定結果完全正確,滴度可達2.00×109(PFU/mL),說明此技術既安全又高效,是完全可行的。C57小鼠缺血后肢中內源性miR-126的表達水平明顯降低,通過Ad‐mir-126局部注射于C57小鼠缺血后肢,可以明顯的提高缺血局部miR-126的表達水平,觀察到促進缺血局部血管新生