大鼠肝移植慢性排斥反應的蛋白組學研究.pdf

1、慢性排斥反應(chronic rejection,CR)是影響移植病人遠期生存的重要因素,且尚無早期臨床和病理診斷的方法。iTRAQ標記的液相色譜質譜聯(lián)用(iTRAQ-LC-MS/MS)聯(lián)合生物信息分析軟件系統(tǒng)(Ingenuity Pathways Analysis,IPA)的使用,是尋找差異蛋白、篩選蛋白分子標志物的理想工具。本研究在建立大鼠肝移植慢性排斥反應模型基礎上,利用iTRAQ和IPA技術篩選肝移植慢性排斥反應的差異蛋白,探討

2、慢性排斥反應的可能發(fā)生機制以及診斷、治療的新靶點。
　　目的:
　　建立大鼠肝移植慢性排斥反應模型,利用iTRAQ和IPA技術篩選相關差異蛋白,旨在探討慢性排斥反應診斷、治療的新靶點和可能的發(fā)病機制。
　　方法:
　　1.優(yōu)化建立大鼠原位肝移植慢性排斥反應模型:SD→Lewis大鼠肝移植分2種組合:A組CsA聯(lián)合氫化可的松干預;B組CsA、氫化可的松及硫唑嘌呤三聯(lián)干預。每組合30例。分別于術后30、60、90和1

3、20d各隨機處死5只,觀察肝臟病理和外周血ALT和TBIL改變。各組除技術死亡的受鼠外,將余受鼠留做生存分析。
　　2.以SD-Lewis大鼠肝移植慢性排斥反應模型為實驗組(n=20),SD-SD大鼠肝移植模型對照組:(n=20),術后120d實驗組和對照組各處死8只受體鼠,收集肝組織用于慢排反應病理學觀察:將肝組織樣本進行HE染色和特殊染色,光鏡下觀察移植肝匯管區(qū)炎癥、膽管炎癥損傷、阻塞性動脈病變以及肝組織纖維化。
　　3

4、.收集肝組織,利用iTRAQ標記技術(同位素標記相對和絕對定量技術)的定量蛋白質組學技術和方法,通過對實驗組與對照組的蛋白表達量進行比較,篩選出差異1.5倍以上(上調或下調)的差異蛋白。
　　4.應用生物信息學技術和軟件IPA分析所有蛋白的細胞定位、細胞功能以及參與的細胞信號通路,并根據(jù)此類信息分析篩選出初步的、有意義的特征差異蛋白。應用IPA分析這些差異蛋白參與的調控網(wǎng)絡和信號通路。
　　5.利用Real-timePCR、

5、WesternBlot及免疫組化方法驗證差異蛋白的表達,進一步篩選與肝移植慢性排斥反應相關的生物標志物。
　　結果:
　　1.肝移植各主要操作步驟時間:熱缺血時間<1min,供體手術20.0±1.5min,供肝修整3.5±1.5min,肝上下腔靜脈吻合8±1.5min,門靜脈重建2.5±1.0min,無肝期<15min,肝下下腔靜脈重建3±1.0min。A組(SD→Lewis,CsA1.0mg/kg/d+氫化可的松0.75m

6、g/kg/d)術后生存時間較B組(SD→Lewis,CsA1.0mg/kg/d+氫化可的松0.75mg/kg/d+Aza2mg/kg/d)明顯縮短。120d時,絕大多數(shù)A組受鼠出現(xiàn)典型慢性排斥反應改變,肝臟縮小,質硬,呈結節(jié)狀,病理染色表現(xiàn)為:肝小葉結構不完整,肝組織顯著纖維化,纖維間隔形成;匯管區(qū)膽管破壞,膽管消失;動脈及其分支管壁炎癥性增厚,管腔縮小≥50％或完全閉塞;CRAI評分≥9分。A組慢排反應較B組明顯。
　　2.應用

7、iTRAQ聯(lián)合液相色譜串聯(lián)質譜(iTRAQ-LC-MS/MS)技術,對慢排實驗組(SD-Lewis)和對照組(SD-SD)進行定量比較蛋白質組學研究,篩查與慢性排斥反應相關的差異蛋白。質譜鑒定總共得到24328條獨特肽段,對應1056個非冗余蛋白質,設定差異1.5倍以上(上調或下調)的蛋白認為有意義,結果顯示有62個蛋白質為肝移植術后慢性排斥反應相關的差異蛋白質,其中32個蛋白表達上調,30個蛋白表達下調。
　　3.經(jīng)IPA數(shù)據(jù)庫

8、(Ingenuity Knowledge Base,GenesOnly)的統(tǒng)計分析,共參與3個主要的通路網(wǎng)絡(參與網(wǎng)絡的蛋白超過15個)。其中脂質代謝/分子轉運/小分子生物化學網(wǎng)絡中涉及蛋白23種,免疫系統(tǒng)疾病/皮膚疾病/結締組織疾病的功能網(wǎng)絡中涉及蛋白22種,而有15種蛋白則參與組成翻譯后蛋白修飾/蛋白質折疊/遺傳疾病的功能網(wǎng)絡。另外Geneoncology功能分析顯示差異蛋白質相互作用網(wǎng)絡涉及多條信號通路中的調控因子,包括:Meth

9、ioninesa lvagepathway、AMPK通路、mTOR通路以及GranzymeA途徑。
　　4.選取6種蛋白進行Q-PCR及免疫組化驗證。與同品系對照組比較,Q-PCR結果顯示慢排組中Lcn2蛋白所對應的基因表達上調(P<0.05),Krt19蛋白所對應的基因表達下調(P<0.05)。免疫組化顯示慢排組織中Lcn2陽性表達率明顯高于對照組肝組織,兩組之間相比有差異(P<0.05)。慢排組織中Krt19明顯低表達(P<0

10、.05)。Lcn2和Krt19蛋白的表達情況與iTRAQ結果高度一致。
　　5.Westernblot檢測慢排反應不同時間段(術后60d,90d,120d)Lcn2及Krt19蛋白的表達。Lcn2蛋白隨著慢性排斥反應程度加重表達量增加,而Krt19蛋白隨著慢性排斥反應程度加重表達量減少。
　　結論:
　　1.SD→Lewis(CsA1.0mg/kg/d+氫化可的松0.75mg/kg/d)組合的大鼠原位肝移植術后肝臟病理

11、改變、肝功能的變化及生存時間均符合臨床上肝移植術后慢性排斥反應的特點,穩(wěn)定可靠,可重復性好,是研究肝移植慢性排斥反應理想的動物模型。
　　2.iTRAQ-LC-MS/MS新技術具有易于操作、重復性好、快速、直觀、高通量觀察蛋白變化的特點,可應用于尋找與慢性排斥反應相關的差異蛋白,適于肝移植慢性排斥反應的基礎研究。
　　3.IPA技術及GO分析可進一步尋找與分析肝移植慢性排斥反應相關的差異蛋白分子,并尋找其相互作用的網(wǎng)絡信號通