NADPH氧化酶與血管重建術后再狹窄的實驗研究.pdf

1、目的：探討NADPH氧化酶在血管壁活性氧(ROS)生成和再狹窄過程中的變化，及其與血管壁細胞增殖、凋亡以及再狹窄的關系，為進一步通過調控NADPH氧化酶-ROS的途徑防治再狹窄提供理論依據(jù)。 方法：本研究分三部分。第一部分通過兔血管平滑肌細胞(VSMC)原代培養(yǎng)，噻唑藍(MTT)法檢測不同濃度過氧化氫(H<,2>O<,2>)對VSMC活力的影響;100μmol／LH<,2>O<,2>作用后不同時段，流式細胞儀檢測VSMC細胞內超

2、氧陰離子(·O<,2><'一>)生成；逆轉錄一聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測VSMC NADPH氧化酶催化亞基p22phox和nox mRNA表達的變化。第二部分體內構建兔髂動脈二次損傷后再狹窄模型，RT-PCR檢測二次損傷后不同時段兔髂動脈p22phox和nox mRNA表達的變化；原位雜交觀察p22phox和nox mRNA表達在血管壁的定位。第三部分體外培養(yǎng)兔VSMC，100μmol／L H<,2>O<,2>作用細胞不同時段后，

3、Annexin v-PI標記檢測VSMC細胞凋亡；Westernblot和實時定量RT-PCR分析VSMCNADPH氧化酶調節(jié)亞基Racl蛋白和mRNA的變化。 結果：①隨H<,2>O<,2>濃度增加，VSMC細胞活力逐漸下降，濃度≥30μmol／L時，各時段吸光度值即有顯著降低(p<0.05)。②100μmo1/L H<,2>O<,2>作用VSMC6、12、24、48h后，VSMC細胞內·O<,2><'－>生成，與正常對照組

4、(DHE陽性細胞百分率7.55％)相比，差異有顯著性(p<0.01)，其作用在24h達峰值(DHE陽性細胞百分率24.01％)。③100μmol／LH<,2>O<,2>作用VSMC 0.5、1、2、4、6h后，與對照組相比，VSMC p22phox mRNA的表達顯著增加p<0.05)，并在1h達峰值；gp91phox和noxl mRNA的表達下降，尤其noxl，與對照組比較，1、2、4、6h組noxl mRNA表達顯著下降p<0.05

5、)。④再狹窄兔髂動脈p22phox mRNA的表達在二次損傷即刻即處于高水平，術后1d略有下降后又逐漸升高，并在14、28d達峰值；gp91phox mRNA的表達在二次損傷后逐漸上升，在14d、28d達到峰值，與術后即刻組比較，差異有顯著性(p<0.01)。⑤在二次損傷后，各時段血管壁p22phox和gp91phox mRNA均可見陽性表達，其表達主要位于新生內膜和外膜。⑥與正常對照組比較(凋亡細胞百分率4.96％)，H<,2>O<,

6、2>處理4h后VSMC細胞凋亡百分率(25.96％)顯著升高(p<0.01)。⑦100μmol／L H<,2>O<,2>作用VSMC 0、15、30、60、120、240min后，VSMC Racl蛋白表達逐漸升高，并在120min達峰值；與正常對照組比較，60、120、240min組RacI蛋白表達升高具有顯著性(p<0.05)，同時Racl rnRNA表達無顯著變化。 結論：①一定濃度的外源性H<,2>O<,2>可促進VS

7、MC生成O<,2><'->，同時誘導VSMC活力下降，導致細胞凋亡。②NADPH氧化酶不同亞基對血管壁細胞的影響呈多樣性，p22phox可能主要參與ROS的生成，nox在再狹窄過程中可能與血管壁細胞增殖，新生內膜形成有關。⑧NADPH氧化酶在再狹窄血管內膜和外膜的高表達，提示該酶主要在外膜與新生內膜發(fā)揮作用。④H<,2>O<,2>誘導VSMC，細胞凋亡同時VSMC Racl蛋白表達升高，后者參與VSMC生成O<,2><'->，并可能通過