七葉皂苷對P-糖蛋白的影響及MDR1 C2005T基因多態(tài)位點功能研究.pdf

1、自古以來天然中草藥在我國有著廣泛的使用,國家十分重視對傳統(tǒng)中草藥的研究,在早期對中草藥提取成分進行高通量的篩選是實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的新課題。中草藥成分復雜,大都以口服給藥途徑為主,研究其在胃腸道的吸收顯得尤為重要。近幾十年來,人們對轉運體進行了深入研究,對這些蛋白的作用和分子機制有了新的認識,其中以P-糖蛋白最受關注。人類P-糖蛋白由位于第7條染色體上的ABCC1基因編碼,是ATP結合盒(ATP bindingcassette,ABC)轉運

2、蛋白超家族成員之一。P-糖蛋白具有ATP酶活性,利用水解ATP釋放的能量將藥物泵出細胞外。P-糖蛋白在正常人體的小腸有著豐富的表達,它能限制藥物的攝取,是影響藥物體內藥代動力學的重要因素。確定化合物是否是P-糖蛋白的底物,對于研究該化合物的藥代動力學十分重要。目前常用的研究方法有以下幾種：頂部表達P-糖蛋白極化細胞單層細胞藥物轉運模型,如Caco-2細胞模型；高表達P-糖蛋白極化細胞單層細胞藥物轉運模型,如LLC—PK1/MDR1和MD

3、CKII/MDR1細胞模型；高表達P-糖蛋白細胞的藥物攝??；如Bcap37/MDR1細胞模型；富含P-糖蛋白的細胞囊膜與藥物的直接作用。
　　 娑羅子是歐洲七葉樹、日本七葉樹和中國天師栗的果實。七葉皂苷是從娑羅子中分離出來的一種重要組分,屬于三萜皂苷類的化合物。七葉皂苷具有消炎、抗?jié)B出、增加靜脈張力、改善血液循環(huán)以及糾正腦功能失常等作用,臨床應用廣泛。但是,七葉皂苷在人體內的生物利用度不高。研究發(fā)現(xiàn),七葉皂苷能抑制P-糖蛋白活性

4、。藥物對藥物轉運體活性的影響,是導致藥物相互作用的主要因為之一。為了最大限度地減少因藥物相互作用而導致的藥物不良反應,指導臨床合理用藥,研究已知藥物對藥物轉運體活性的影響具有重要的臨床意義?；谝陨涎芯勘尘?本課題旨在研究七葉皂苷對P-糖蛋白在體外和體內產生的影響及其臨床意義。通過考察七葉皂苷對P-糖蛋白功能的影響以及P-糖蛋白對七葉皂苷跨膜轉運的影響,探討藥物與P-糖蛋白的相互作用,并進一步通過嚴格設計的臨床實驗,以他林洛爾為探藥,基

5、于轉運體的遺傳多態(tài)性對其功能的影響,在整體藥代動力學水平和藥物相互作用層面探討七葉皂苷對P-糖蛋白活性的影響,為臨床上藥物相互作用及個體反應差異提供分子水平的解釋,并為臨床實施中西藥合理運用和基因導向性個體化用藥提供指導。本研究主要內容及結果如下：
　　 ⑴穩(wěn)定表達MDR1-LLC-PK1細胞平臺的建立全長的MDR1 cDNA片段經過酶切與真核表達載體pcDNA3.1(-)相連,酶切和DNA測序確認表達載體構建正確。質粒pcDN

6、A3.1/MDR1通過Lipo2000轉染LLC-PK1細胞,經G418篩選得到抗性單克隆。所建立的穩(wěn)定表達MDR1的LLC-PK1細胞和空轉載體pcDNA3.1(-)的LLC-PK1細胞相比,實時熒光定量RT-PCR發(fā)現(xiàn)MDR1的mRNA表達明顯升高；western blot表明,P-糖蛋白的表達發(fā)生了從無到有的變化；激光共聚焦顯示,P-糖蛋白定位于LLC-PK1/MDR1細胞膜上；藥敏實驗結果顯示,LLC-PK1/MDR1對秋水仙素

7、的敏感性遠低于對照細胞。
　　 ⑵MTT試驗結果顯示100μM七葉皂苷及50μM維拉帕米對細胞無毒性,細胞活性>90％；七葉皂苷和維拉帕米不會激發(fā)或淬滅熒光,不對實驗造成干擾；60分鐘內,細胞對羅丹明123的攝取最快；1-50μM七葉皂苷對P-糖蛋白介導的羅丹明123外排有顯著抑制作用(P<0.05),且呈劑量依賴性,50μM七葉皂苷使細胞內熒光強度增加123％；七葉皂苷可以抑制P-糖蛋白功能,但其抑制效果較維拉帕米弱,50μM

8、七葉皂苷的抑制效果約為50pM維拉帕米的30％。
　　 ⑶反向高效液相-質譜檢測LLC-PK1/MDR1細胞內七葉皂苷的方法學建立。流動相乙腈:10mM甲酸銨=40:60(V/V；含0.2％甲酸)；流速1.0mL/min；柱溫40℃；檢測波長203nm。采用電噴霧電離正離子模式(ESI+),毛細管電壓3.1kV,去溶劑氣溫度400℃,離子源溫度119℃。七葉皂苷在0.039-20μg/mL,范圍內線性良好,七葉皂苷的萃取回收率大

9、于80.6％,三個濃度的日內、日間差均小于17％,最低定量限為O.039μg/mL。七葉皂苷在37℃下細胞的攝取量隨濃度的增加而增加,然而通過比較藥物濃度與攝取量的關系,發(fā)現(xiàn)七葉皂苷的攝取曲線是直線,反映了藥物的吸收可能是被動擴散過程。同時,在藥物轉運實驗中發(fā)現(xiàn),隨著藥物濃度的變化,藥物的表觀滲透系數(shù)(Papp)保持穩(wěn)定,進一步證實藥物的吸收是被動擴散。
　　 ⑷采用他林洛爾作為探藥,在不同MDR1基因型個體研究了七葉皂苷對人體

10、P-糖蛋白轉運活性的影響。連續(xù)服用14天七葉皂苷后,他林洛爾AUC(0～36)增加了54.7％,AUC(0～∝增加了56.4％,Cmax增加了35.0％,而達峰時間tmax和半衰期t1/2沒有發(fā)生顯著改變。七葉皂苷顯著增加他林洛爾的血藥濃度,提示七葉皂苷在人體內抑制了P-糖蛋白轉運活性。
　　 ⑸綜合以上實驗結果,得到如下結論：①成功構建穩(wěn)定高表達P-糖蛋白的LLC-PK1細胞平臺,P-糖蛋白定位準確,具有功能意義。②七葉皂苷對