玉米淀粉分支酶基因表達(dá)調(diào)控的研究.pdf

1、吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文玉米淀粉分支酶基因表達(dá)調(diào)控的研究姓名：柴曉杰申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：作物遺傳育種指導(dǎo)教師：王丕武20050601吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文玉米淀粉分支酶基因表達(dá)調(diào)控的研究的含量有所下降。4克隆了玉米淀粉分支酶的基因片段(935bp)。將反義正義基因片段插入到pBll2135S啟動(dòng)子下，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pCJSBE2b。通過(guò)花粉管通道法將其導(dǎo)入玉米自交系，獲得To代轉(zhuǎn)化的籽粒，萌發(fā)后以單棵植株葉片的總DNA為模板，35

2、S啟動(dòng)子和終止子中的一對(duì)序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果從3棵植株中得到2500bp的特異性擴(kuò)增條帶，而未轉(zhuǎn)化的植株中無(wú)該片段的產(chǎn)生。為進(jìn)一步確定外源基因的整合情況，對(duì)PCR陽(yáng)性植株進(jìn)行Southernblot分析。結(jié)果表明，3株均有雜交帶出現(xiàn)，結(jié)合表達(dá)質(zhì)粒HindllI酶切位點(diǎn)分布情況，可以推斷外源基因插入拷貝數(shù)依次為1、1、2。而未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植林沒(méi)有雜交信號(hào)出現(xiàn)。證明外源基因已整合到基因組中。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株T1代的PCR分析結(jié)果表明，外源

3、基因在轉(zhuǎn)基因后代中能夠遺傳，其分離比符合孟德?tīng)柕倪z傳規(guī)律。以轉(zhuǎn)基因玉米籽粒的總RNA為模板，與DIG標(biāo)記的探針進(jìn)行Northem雜交，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)源SBEmRNA的含量明顯下降，證明外源基因能正常表達(dá)并導(dǎo)致內(nèi)源淀粉分支酶mRNA降解。5以To代轉(zhuǎn)化的籽粒為材料，采用分光光度法對(duì)淀粉分支酶活性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因玉米的分支酶活性分別為4895U、73945u、48015U、9611u和10524u，與對(duì)照(33285u)相比有

4、明顯的下降，淀粉分支酶活l生降低了85％、78S、85S、71％和68％。說(shuō)明外源基因的導(dǎo)入有效地抑制了淀粉分支酶基因的表達(dá)。6以To代轉(zhuǎn)化的籽粒為材料，采用雙波長(zhǎng)法對(duì)直鏈淀粉衣支鏈淀粉的含量進(jìn)行了測(cè)定，轉(zhuǎn)基因植株的淀粉含量測(cè)定結(jié)果顯示，總淀粉含量分別為680mg、690mg、680mg、673mg和687mg(每克干重籽粒)與對(duì)照基本沒(méi)有變化(693mg／g干重籽粒)，而直鏈淀粉的含量(親本為23％)卻有明顯的提高，分別達(dá)到50％、4