腸缺血再灌注后腸黏膜屏障功能改變及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的： 1、MODS最初的病理形態(tài)記述多為患者死后尸檢所見，系晚期病變。以后陸續(xù)有了動(dòng)態(tài)的、較系統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)病理學(xué)研究資料。但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對象主要為大鼠、家兔、山羊等，用這些離人類種屬差異較大的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)資料尚難解釋很多臨床現(xiàn)象。靈長類動(dòng)物獼猴在生理上與人類較接近，本系列研究擬通過觀察了IIR獼猴觀察靈長類動(dòng)物IIR后重要器官病理及功能變化。 2、由于腸道在MODS發(fā)生中，不僅是受損器官，更是全身炎癥反應(yīng)的策源地，本

2、研究將比較腸缺血再灌注前后腸粘膜及外周血中SST水平，以求證內(nèi)源性SST在MODS發(fā)生中的可能重要作用。進(jìn)一步明確SST是否對人類MODS有預(yù)防或治療作用?以期獲得對臨床治療MODS有實(shí)用價(jià)值的信息。 3、防御素(defensin)是生物在長期進(jìn)化過程中保留下來的一種古老的宿主防御機(jī)制，是抵御外來微生物入侵的重要物質(zhì)。位于小腸隱窩基底部的潘氏細(xì)胞可合成、分泌腸源性防御素，它可能通過損傷細(xì)菌細(xì)胞膜對多種細(xì)菌發(fā)揮強(qiáng)大的殺菌活性，是腸

3、粘膜屏障的重要組成部分，在腸道天然免疫中具有重要作用。我們近期的研究觀察到，腸缺血再灌注(intestinal ischemia repeffusion，IIR)后，小腸腔內(nèi)細(xì)菌量較正常增加約2×10<'6>倍。腸源性防御素對此的反應(yīng)如何?腸道作為多器官功能障礙綜合癥(multiorgan dysfunction syndrome，MODS)的重要策源地，是否因腸腔內(nèi)大量細(xì)菌與腸源性防御素之間的失衡有關(guān)?腸粘膜內(nèi)顯著變化的SST與腸源性

4、防御素是否具有相關(guān)性?IIR后小腸粘膜強(qiáng)烈的天然免疫反應(yīng)與腸源性防御素有何關(guān)聯(lián)腸道作為多器官功能障礙綜合癥(multiorgandysfunction syndrome，MODS)的重要策源地，是否因腸腔內(nèi)大量細(xì)菌與腸源性防御素之間的失衡有關(guān)?4、腸相關(guān)淋巴組織(gut-associated lymphoid tissue，GALT)是體內(nèi)最大的免疫器官，GALT產(chǎn)生的抗體量多于其它淋巴器官(脾、淋巴結(jié)、骨髓)產(chǎn)生抗體量的總和，其中分泌

5、型lea的產(chǎn)量為3-5g／天，生理情況下體液免疫腸道免疫中占有舉足輕重的地位。只有個(gè)別的研究報(bào)導(dǎo)，IIR后腸道T、B淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，腸腔lea的總量基本沒變，但沒有slgA的更多資料。由于分泌型Iea(secretory Immunoglobulin A sIgA)的分泌涉及Iea單體、J鏈、IgA雙體、分泌片(secretory component，SC)等眾多環(huán)節(jié)，腸道真正發(fā)揮作用的是sIgA。而且有關(guān)腸粘膜體液免疫研究的實(shí)驗(yàn)對象

6、又主要為大、小鼠，用這些離人類種屬差異較大的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)資料尚難準(zhǔn)確解釋很多臨床現(xiàn)象。再加上臨床上腸道標(biāo)本取材的不可行性，人體內(nèi)IIR后腸粘膜體液免疫發(fā)生了什么樣的改變，這種變化在IIR后的后續(xù)病理改變中又占有怎樣的位置，目前仍不清楚。本研究擬通過觀察與人類種屬關(guān)系接近的動(dòng)物—獼猴IIR時(shí)腸粘膜體液免疫中漿細(xì)胞、Iea、分泌片、slgA所發(fā)生的變化，從多個(gè)層面探討IIR對腸體液免疫功能的影響。 研究方法： l、動(dòng)物：全部實(shí)

7、驗(yàn)所用健康成年獼猴來自成都野生動(dòng)物世界，雌雄不限，體重4～6Kg。15只健康獼猴分為3組，每組5只動(dòng)物。 正常對照組：給獼猴肌注復(fù)方二甲苯胺噻嗪(解放軍軍需大學(xué)獸醫(yī)研究所，長春，中國)以麻醉動(dòng)物，0.06～0.24ml／kg。動(dòng)物麻醉后，采集外周靜脈血及手術(shù)取出小腸、心、肝、腎、肺、腦等器官進(jìn)行組織學(xué)觀察。 ⅡR組：麻醉同前，實(shí)驗(yàn)過程中用安定靜注0.16±0.09mg/Kg/h維持昏睡狀態(tài)。無菌鋪巾，沿腹正中切開，分離腸

8、系膜上動(dòng)脈后予以夾閉，60 min后松夾進(jìn)行再灌注，恢復(fù)腸系膜上動(dòng)脈血流。再灌注后1h，靜脈輸入0.9[％]鹽水，0.1～0.2ml/kg/min。24h后取出各臟器。 ⅡR+SST組：大部分同ⅡR組，僅在夾閉腸系膜上動(dòng)脈前，從靜脈滴注生長抑素5μg/Kg/h，持續(xù)至再灌注后24h，處死動(dòng)物，取出各臟器。與正常和ⅡR組比較其病理和功能變化2、實(shí)驗(yàn)方法用大體病理檢查及H-E染色光鏡下觀察評估各重要臟器官組織病理損傷程度，并于術(shù)前

9、后實(shí)驗(yàn)結(jié)束后血中肝、腎功能，血常規(guī)、DIC等研究。觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臨床表面。 用放射免疫測定法測定外周血中的生長抑素的含量；用放射免疫法及免疫組織化學(xué)法測定回腸粘膜中生長抑素的含量。用EIASA測定回腸組織中β-防御素-2和分泌型IgA的含量。用免疫組織化學(xué)加圖像分析測定回腸組織中α-防御素-6、IgA、漿細(xì)胞、分泌片的含量。 研究結(jié)果 l、外周血與小腸粘膜中SST的變化放射免疫分析結(jié)果表明，ⅡR后外周血SffT較正

10、常對照明顯下降，靜脈補(bǔ)充SST后，循環(huán)中SST水平回升。正常獼猴小腸粘膜隱窩部可見SST陽性染色；ⅡR后，粘膜SST明顯減少。ⅡR前靜脈預(yù)防性應(yīng)用SST后，粘膜SST較ⅡR組明顯回升。 2、SST改善ⅡR引起的器官組織損傷 預(yù)防性使用SST后，重要臟器病理組織學(xué)較IIR時(shí)組織水腫減輕，細(xì)胞變性和壞死明顯減少。其中肺、小腸、肝、腎和胰腺的損傷評分從+++降到++，大腸、大腦和小腦的損傷評分從++降到+。IIR及IIR+SS

11、T時(shí)，心臟均無明顯組織病理改變。 IIR+SST組獼猴在腸缺血后早期血壓變化與IIR組一致，平均動(dòng)脈壓在2h內(nèi)急速下降到最低值，但恢復(fù)腸系膜上動(dòng)脈血流灌注及靜脈補(bǔ)液后，IIR+SST組的平均動(dòng)脈壓穩(wěn)定回升，18h后穩(wěn)定在術(shù)前水平，明顯高于IIR組；心率和呼吸升高幅度在IIR后16h也較IIR組低而穩(wěn)定。動(dòng)物血中ALT、AST及BUN雖然仍高于正常，但明顯低于IIR組(P<0．05)。出現(xiàn)腹脹的時(shí)間較IIR組明顯延遲(IIR后10

12、-14h)，而且僅為胃內(nèi)積氣，小腸積氣不明顯；體溫<35℃的時(shí)間明顯短于IIR組(持續(xù)24h)，平均為2h，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前體溫均>37℃，最高達(dá)38．3℃ 3、SST對腸道防御不的影響 IIR后，粘膜隱窩部的a-防御素-6明顯減少，預(yù)防性補(bǔ)充SST后，粘膜隱窩部的α-防御素-6顯著回升，與正常時(shí)無顯著差異。IIR后隱窩部β-防御素-2明顯增加，預(yù)防性補(bǔ)充SST后，粘膜隱窩部的β-防御素-2仍持續(xù)增加。 二、IIR后體

13、液免疫變化 正常組見漿細(xì)胞大量分布在粘膜層(特別是固有層)，在粘膜下層呈散在分布。IIR組粘膜層(上皮內(nèi)+固有層)漿細(xì)胞明顯減少(p<0．05)；IIR+SST組粘膜層漿細(xì)胞較IIR組明顯增多(p<0．05)，仍少于正常組；IIR組固有層無IgA的表達(dá)，粘膜下層IgA減少，腸腔明顯減少。IIR+SST組粘膜下層IgA較IIR組增多，腸腺隱窩腔內(nèi)出現(xiàn)Iga。 ELIS A檢測發(fā)現(xiàn)IIR組和IIR+SST組腸上皮及腸腔sIg

14、A的水平在兩組之間沒有差異(p>0.05)，但都明顯低于正常。正常獼猴腸粘膜上皮細(xì)胞SC染色淡，主要位于絨毛上皮細(xì)胞的腔面和基底面，而腸腔濃染明顯。IIR組上皮細(xì)胞的腔面和基底面的SC分泌都明顯增多。IIR+SST組SC較正常似有增多，但積分光密度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)結(jié)論： 1、嚴(yán)重的腸道缺血對全身循環(huán)的負(fù)面影響遠(yuǎn)大于肢體或其它器官血容量下降的后果，其組織病理的炎性損傷特征是含免疫細(xì)胞多的臟器最先受累，這些結(jié)果增進(jìn)了對

15、人類MODS發(fā)生的認(rèn)識。 2、SST對IIR后MODS有良好的預(yù)防效果。 3、IIR時(shí)小腸內(nèi)細(xì)菌過度生長及菌群譜的變化與粘膜內(nèi)a-防御素-6和β-防御素-2的變化無關(guān)；小腸隱窩內(nèi)變化的a-防御素-6受SST調(diào)控，可能影響隱窩部位多種細(xì)胞的生理功能；小腸隱窩內(nèi)β-防御素-2主要受粘膜內(nèi)NF-κB及炎癥介質(zhì)的誘導(dǎo)，發(fā)揮其免疫趨化的作用。 4、IIR將使腸道體液免疫遭到嚴(yán)重破壞。SST可促進(jìn)粘膜及粘膜下漿細(xì)胞的成熟和聚