巴戟天糖鏈促血管生成及血管內皮細胞遷移的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 近年來,缺血性心臟病發(fā)病率逐年上升,全世界發(fā)病率為2％。心肌梗死(myocardial infarction,MI)是目前嚴重危害人類健康的疾病之一,而慢性心功能衰竭(chronic heart failure,CHF)是MI致死的主要原因之一。分子搭橋術(molecular bypass,又名治療性血管新生therapeutic angiogensis)為缺血性損傷的心肌細胞及衰竭的心肌細胞功能恢復提供

2、了一種全新的治療策略。分子搭橋術,即通過一些方法的刺激包括某些藥物的治療作用在病損心肌區(qū)域增加功能性(治療性)的冠狀動脈分支或側支,以達到恢復缺血心肌血供,改善患者癥狀和預后的目的。近十年的研究結果證實,分子搭橋能幫助機體建立有效的側支循環(huán),從根本上緩解心肌缺血癥狀,改善病情,從而分子搭橋已經成為目前世界心血管醫(yī)學領域的熱點課題。因此,深入研究分子搭橋的內在機制以及開發(fā)有效的促進分子搭橋藥物,必將極大的提高缺血性心臟病人的生活質量和壽命

3、長度。本導師組近年來一直致力于巴戟天糖鏈(Morinda officinalisoligosaccharides,MOO)保護心臟作用的研究,前期的研究已證實:MOO具有明顯的減輕缺氧復氧或缺血再灌注對心肌細胞的損傷；可以促進雞胚絨毛尿囊及大鼠缺血心肌中血管的生成；增加其微血管(MVD)的數量及密度；顯著上調與血管新生相關的VEGF、bFGF蛋白的表達；血管生成基因芯片結果顯示MOO可顯著上調多種促血管生成基因mRNA的表達,下調多種抑

4、制血管生成基因mRNA的表達；MOO可劑量依賴性的提高血管細胞中TRPC6蛋白的表達。因此,本實驗以人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)為研究對象,采用血管內皮遷移和小管生成實驗觀察MOO對缺氧復氧損傷內皮細胞遷移及管腔樣結構的形成的影響,采用流式細胞儀技術觀察缺氧復氧損傷后各組細胞的增殖情況,旨在進一步觀察MOO促血管生成效應,并為其在缺血心肌保護及促進缺血心臟建立側枝循環(huán)方面的作用提供更加直觀的實驗依據。
　　 1 HUVEC細胞

5、的培養(yǎng)
　　 HUVEC細胞接種到50ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng),加入含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,在37℃,5％CO2,飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d,細胞逐漸長成單層融合狀。倒置顯微鏡下觀察細胞核圓,核膜清晰,細胞呈梭形多邊狀,表現(xiàn)為典型鋪路石樣。當培養(yǎng)瓶長滿80％左右即可用胰蛋白酶消化傳代或凍存。
　　 2細胞模型的制作與確定
　　 種板培養(yǎng)24h后,各孔棄去培養(yǎng)基,用無糖Earle's液洗細胞2次,正常對

6、照組加入1640培養(yǎng)基；模型組加入含連二亞硫酸鈉終濃度為1mM的無糖Earle's液,造成細胞缺氧復氧損傷,陽性藥對照組加入麝香保心丸(2 g·L-1),MOO各組加入含連二亞硫酸鈉終濃度為1mM的無糖Earle's液及MOO大(0.45 g·L-1)、中(0.15 g·L-1)、小(0.05 g·L-1),37℃孵育4h；取出培養(yǎng)板,吸棄各實驗孔液體,用無糖Earle's液洗細胞2次,各實驗孔均換含藥的無血清1640培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)1

7、2h,造成細胞復氧損傷。
　　 3實驗分組
　　 本實驗分為六組:
　　 ①正常細胞組
　　 ②缺氧復氧損傷模型組
　　 ③缺氧復氧損傷模型+陽性對照藥麝香保心丸組(2g／L)
　　 ④缺氧復氧損傷模型+小劑量MOO組(0.05g／L)
　　 ⑤缺氧復氧損傷模型+中劑量MOO組(0.15g／L)
　　 ⑥缺氧復氧損傷模型+大劑量MOO組(0.45g／L)
　　 4觀

8、察指標
　　 正常培養(yǎng)HUVEC細胞3～8代,制作缺氧復氧損傷模型,給予不同劑量MOO干預12h,①倒置顯微鏡觀察其生長狀態(tài)；②流式細胞儀檢測各實驗組細胞生長狀況；③觀察在缺氧復氧條件下各組人臍靜脈內皮細胞的遷移狀況；④觀察在缺氧復氧條件下各組人臍靜脈內皮細胞的小管形成狀況。
　　 5統(tǒng)計學處理
　　 統(tǒng)計學處理用SPSS16.0。計量資料數據用均數±標準差((x)±s)表示。檢驗結果均取a=0.05作為檢驗水準

9、。組間比較采用單因素方差分析,當差異有顯著意義時進一步用q檢驗進行兩兩比較。
　　 結果:
　　 1損傷4h后,鏡下可見模型組細胞收縮變圓,細胞形態(tài)不規(guī)則,間隙明顯變大,并有部分脫落。
　　 2流式細胞儀檢測結果顯示:與正常組相比,缺氧復氧模型組增加了G2+S期的細胞,與模型組相比,MOO大、中劑量減弱了這種趨勢,使細胞狀態(tài)更接近于正常細胞,小劑量的MOO的作用不明顯。
　　 3與缺氧復氧損傷模型組對比,