家族性高膽固醇血癥LDLR新突變體的構(gòu)建及其功能研究.pdf

1、家族性高膽固醇血癥(FH)是一種常染色體單基因顯性遺傳性疾病,FH的主要臨床表現(xiàn)為血漿總膽固醇(TC),特別是低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)顯著升高,皮膚肌腱黃色瘤及早發(fā)冠心病等。LDLR基因突變是引起FH最常見的原因,臨床確診的FH患者中約一半以上為L(zhǎng)DLR基因突變。本課題組共收集30多個(gè)FH家系,已發(fā)現(xiàn)20種LDLR基因點(diǎn)突變,包括16種點(diǎn)突變、2種剪接突變和2種缺失突變,但這些突變是否具有致病性,其致病機(jī)制如何均不清楚。為了明確

2、高脂血癥的原因,深入了解FH的分子學(xué)機(jī)制和發(fā)病機(jī)理,本實(shí)驗(yàn)在突變分析的基礎(chǔ)上,選用6種突變進(jìn)行突變體構(gòu)建和功能研究。
　　[目的]
　　以6例臨床確診的FH患者為研究對(duì)象,對(duì)各患者進(jìn)行LDLR基因突變分析,構(gòu)建野生型和突變體LDLRcDNA真核表達(dá)載體,將構(gòu)建的各表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞,通過各突變體與野生型比較,重點(diǎn)觀察各突變對(duì)LDLR表達(dá)和功能的影響,初步探討突變對(duì)LDL代謝的作用及突變致FH的分子機(jī)制,并為突變患

3、者采取早期治療,防治心血管疾病及產(chǎn)前診斷和家族性研究等提供理論基礎(chǔ)。
　　[方法]
　　取6例臨床確診FH患者EDTA-Na2抗凝血各0.5ml,用酚-氯仿法提取基因組DNA,以基因組DNA為模板,采用PCR結(jié)合DNA測(cè)序方法排除ApoB基因Q3500R突變;同時(shí)以患者基因組DNA為模板,采用降落PCR方法,在同一程序中擴(kuò)增LDLR基因的啟動(dòng)子和全部18個(gè)外顯子共21個(gè)片段,直接進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定突變。用Trizol法從正常

4、人肝細(xì)胞中提取總RNA并純化,并以純化RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄PCR合成LDLRcDNA全長(zhǎng);將LDLRcDNA全長(zhǎng)與PTA2載體連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌、篩選菌落、提取質(zhì)粒酶切和測(cè)序鑒定,將正確PTA2載體克隆質(zhì)粒送交廣州復(fù)能基因公司負(fù)責(zé)組裝到真核表達(dá)載體pReceiver-M29,構(gòu)建成含LDLR全長(zhǎng)和EGFP綠色熒光蛋白融合表達(dá)的載體。以野生型表達(dá)載體為模板,用QuickChange XL system誘變?cè)噭┖?Stratagene)構(gòu)建

5、6種突變體(357delG,675delA, C210R, T383I, A459V, S565X)并經(jīng)測(cè)序證實(shí)。將野生型及6種突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞,同時(shí)設(shè)一空白對(duì)照(未轉(zhuǎn)染任何基因),轉(zhuǎn)染48h后提取總蛋白,采用Western檢測(cè)LDLR蛋白;另外,將野生型及構(gòu)建的6種新突變體質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞,48h后分別在4℃和37℃與稀釋在培養(yǎng)基中的DiI-LDL共孵育,流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)LDLR結(jié)合、內(nèi)化LDL的能力。

6、
　　[結(jié)果]
　　各FH患者均未檢測(cè)出ApoB100Q3500R突變,LDLR突變分析發(fā)現(xiàn)6個(gè)新突變,包括3個(gè)錯(cuò)義突變(C210R, T383I, A459V)、2個(gè)缺失突變(357delG,675delA)和一個(gè)無義突變(S565X)。篩選得到正確LDLR及突變體表達(dá)載體,測(cè)序結(jié)果無堿基突變及閱讀框移碼。Western檢測(cè)顯示,與野生型比較,C210R, T383I, A459V三種錯(cuò)義突變蛋白條帶無顯著變化;S565X

7、出現(xiàn)一條截短的蛋白條帶;2個(gè)缺失突變(357delG,675delA)出現(xiàn)一條更短的蛋白條帶。與野生型比較,6個(gè)LDLR基因新突變體導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)合能力、內(nèi)化能力均明顯降低,分別約為野生型的13％-34%,13%-35%。
　　[結(jié)論]
　　1、成功構(gòu)建6種LDLR新突變體。
　　2、6個(gè)LDLR基因新突變均損傷LDLR功能,細(xì)胞結(jié)合能力明顯降低(13%-34%),內(nèi)化能力也明顯降低(13%-35%),其中LDLR基因突變