山羊精原細胞體外分離及培養(yǎng)分化與移植.pdf

1、　　作為成年動物體內(nèi)唯一能進行終生自我更新且遺傳親代基因給子代的一類二倍體永生細胞群，精原干細胞(SSCs)持續(xù)、高產(chǎn)的精子發(fā)生進程使其成為體外操作的理想宿主干細胞，十年來各種屬動物的成功移植有力促進了相關技術的完善與發(fā)展。為了給后續(xù)的轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術方法，本實驗主要進行山羊精原干細胞的分離、培養(yǎng)與移植研究，結果如下：1、采用四種酶組合分離二月齡關中奶山羊精原細胞，A組：膠原酶Ⅳ；B組：膠原酶Ⅳ+透明質(zhì)酸酶；C組：膠原酶

2、Ⅳ+透明質(zhì)酸酶+胰蛋白酶與EDTA；D組：膠原酶Ⅳ+透明質(zhì)酸酶+胰蛋白酶與EDTA+DnaseⅠ。結果C、D組不但組織塊解離效果及細胞離散程度均較A、B好，且原代培養(yǎng)細胞團塊數(shù)少。多重比較C、D組顯著優(yōu)于A、B組；C組與D組差異不顯著，但與A、B組比較細胞存活率、圓形細胞比率及貼壁率差異極顯著，結果膠原酶Ⅳ+透明質(zhì)酸酶+胰蛋白酶與EDTA是較經(jīng)濟有效的山羊SSCs分離酶組合?！　?、為探索山羊SSCs體外培養(yǎng)體系，我們收集2月齡關中奶

3、山羊睪丸，一步酶法消化分離曲細精管細胞，臺盼蘭檢測平均存活率82.7﹪，以1×106/ml接種含15﹪胎牛血清(FBS)DMEM/F12培養(yǎng)瓶，37℃，5﹪CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)，4wk后FBS逐漸降至10﹪。原代培養(yǎng)以多突起和片狀的睪丸體細胞鋪壁生長為主，10d左右精原干細胞數(shù)量增加，可見二聯(lián)體和四聯(lián)體，3wk左右有鳥巢狀和山脈狀集落形成，堿性磷酸酶染色陽性，培養(yǎng)30d集落數(shù)不斷增加，散在分布有貼壁和漂浮精子，換液后精子丟失。挑取

4、單集落重新接種鋪壁的曲細精管體細胞飼養(yǎng)層后陸續(xù)有精子細胞及精子形成，主要分布于集落周圍?！　?、為掌握山羊SSCs睪丸移植適用方法，我們采用兩步酶法消化分離2～3月齡SSCs，以6.5×106/ml分別通過睪丸輸出管、B超介導睪丸網(wǎng)(多點和單點)和徒手睪丸網(wǎng)三種方法移植。結果經(jīng)過輸出管幾乎不能移植細胞進曲細精管，B超介導睪丸網(wǎng)移植每枚睪丸可移植約4.5ml細胞混合物，覆蓋曲細精管35～40﹪，徒手最多移植了6ml，曲細精管覆蓋率最高達