骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療潰瘍性結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerativecolitis，UC)是一種原因不明的慢性非特異性結(jié)腸炎。其病情易復(fù)發(fā)，遷延不愈，可致嚴(yán)重并發(fā)癥，已成為臨床治療的一個(gè)難題。本病在歐美等國(guó)家常見，近年來我國(guó)該病的發(fā)病率有明顯增高趨勢(shì)。其確切的病因和發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚，認(rèn)為與免疫系統(tǒng)失常、遺傳易感性、環(huán)境及精神等多種因素密切相關(guān)。UC的治療方法有多種，但均療效不太令人滿意。國(guó)外有應(yīng)用干細(xì)胞移植治療UC的個(gè)案報(bào)道，但尚缺乏系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究。

2、本文旨在通過將同種異體大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)移植入大鼠UC模型后，探討MSCs在大鼠UC模型結(jié)腸的定位情況；探討移植后大鼠UC模型血清中的TNF-α、IL-10含量的變化。從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)角度探討MSCs移植治療UC的可行性。 材料與方法： 實(shí)驗(yàn)對(duì)象選擇健康雌性的SD大鼠，約8周齡，體重約180-200g。隨機(jī)分為A組為UC模型移植組，B組為UC模型對(duì)照組，C組為酒精對(duì)照組。

3、A、B組均采用三硝基苯磺酸(TNBS)與酒精復(fù)合灌腸法建立UC模型，C組用酒精灌腸作為對(duì)照。用貼壁法以PBS-LDMEM培養(yǎng)基體外連續(xù)傳代培養(yǎng)獲得雄性SD大鼠的MSCs。A組造模后24小時(shí)，將0.4ml含2×106個(gè)MSCs的細(xì)胞懸浮液經(jīng)尾靜脈注射于UC模型的大鼠體內(nèi)，同時(shí)B、C兩組亦于灌腸后24小時(shí)注射0.4ml的生理鹽水作為對(duì)照。分別于移植后第1天、第7天、第21天每組各取6、6、4只大鼠，手術(shù)切取遠(yuǎn)端結(jié)腸組織，用于制作病理切片(H

4、-E染色)以觀察其形態(tài)學(xué)變化，以及用于檢測(cè)髓過氧化物酶(MPO)及提取DNA進(jìn)行sry區(qū)段的檢測(cè)。后者經(jīng)PCR方法檢測(cè)Y染色體的性別決定區(qū)段(sry)作為定位的標(biāo)志，以確定MSCs的腸道定位情況。組織中的髓過氧化物酶活性用二甲氧基聯(lián)苯胺-過氧化氫法檢測(cè)。同時(shí)，經(jīng)腹主動(dòng)脈無菌采血，提取血清，用于檢測(cè)血清中細(xì)胞因子IL-10和TNF-α的含量，以觀察炎癥因子的變化情況。 結(jié)果： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞于培養(yǎng)后24小時(shí)內(nèi)貼壁，5～6

5、天后，貼壁細(xì)胞體積增大呈梭形，有粗大突起伸出，部分細(xì)胞呈多角形，除部分細(xì)胞單個(gè)散在外，細(xì)胞多數(shù)聚集成集落；10～12天左右細(xì)胞鋪成單層，排列成旋渦狀，呈梭形或多角形，傳代3次后即可移植。計(jì)數(shù)50mL體積培養(yǎng)瓶中細(xì)胞數(shù)目可達(dá)5×106個(gè)/瓶。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD44陽性率為89.58％，CD54陽性率為95.54％。 大鼠UC模型病理學(xué)上可見結(jié)腸粘膜的毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血、水腫，大量的淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。粘膜上皮細(xì)胞間有中性粒

6、細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體呈環(huán)狀，腺細(xì)胞減少或消失，有隱窩膿腫及潰瘍形成等一系列類似人UC的病理變化。A、B組的髓過氧化物酶(MPO)于第1天(A組：3.57±0.39，B組：3.33±0.56)、第7天(A組：2.38±0.59，B組：2.18±0.67)均較C組(第1天：1.15±0.39，第7天：0.84±0.40)明顯升高(p＜.05)。在B組，與第1天(3.33±0.56)相比，第7天(2.18±0.67)和第21天(1.49±0.39)

7、顯著增高(p＜0.05)，而第7天、第21天之間無顯著差異(P＞0.05)表明A、B兩組炎癥明顯，并于第7天炎癥達(dá)高峰，隨后降低。 移植后sry檢測(cè)顯示：第1天，第7天和第21天陽性率分別為0％(0/6)，16.7％(1/6)和50.0％(3/6)，而對(duì)照組均陰性。 A、B組血清TNF-α(A組：52.8±16.7，B組：53.6±10.5)與IL-10含量(A組：161.6±23.0，B組：153.6±12.8)于第1

8、天均較C組(C組TNF-α：28.6±7.8，IL-10：112.7±30.9)升高(p＜0.05)，但第7天(A組TNF-α：26.4±17.0，IL-10：133.7±10.3;B組TNF-α：36.8±12.7，IL-10：133.4±6.1)，第21天時(shí)(A組TNF-α：25.5±8.8，IL-10：133.7±13.2;B組TNF-α36.5±14.8，IL-10：128.9±31.2)均與C組(第7天TNF-α：30.4±1

9、0.2，IL-10：131.0±10.3;第21天TNF-α：31.3±9.4，IL-10：140.6±7.6)無差異(P＞0.05)，且A、B兩組在各時(shí)期比較均無明顯差異(P＞0.05)。 結(jié)論： 1.潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型血清中TNF-α的水平和IL-10的水平均于炎癥早期明顯升高。2.同種異體大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后其能在潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型的腸道中定位。 3.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型血清