菜粉蝶不同發(fā)育階段mRNA與miRNA轉錄組的高通量測序分析.pdf

1、菜粉蝶（Pieris rapae），鱗翅目:粉蝶科，農業(yè)上是重要的害蟲之一，主要危害十字花科蔬菜。在基礎研究中，菜粉蝶及其重要天敵蝶蛹金小蜂是自體免疫的重要的相互作用模型，然而其基因組尚未測序。轉錄組測序亦可為菜粉蝶基因表達、生物學以及防治策略提供全局性的視角。故本論文以菜粉蝶不同發(fā)育階段的基因轉錄與表達為研究目標，對菜粉蝶不同生長發(fā)育階段構建了六個mRNA庫和六個small RNA庫，應用illumina測序，通過基因注釋與發(fā)育轉錄表

2、達分析，以期獲得菜粉蝶發(fā)育轉錄組并挖掘出與發(fā)育有關的基因。
　　對于mRNA序列，主要內容包括轉錄組拼接、轉錄組注釋與發(fā)育相關基因的篩選。首先通過de novo拼接方法，生成了96,069條unigenes序列和196,202條transcripts序列，其N50和轉錄本拼接序列的平均長度達到2269bp和1206bp。其中31,774（33％）條unigenes序列能顯著性比對到NCBI中非冗余蛋白數據庫，篩選出16500條具有

3、完整的ORF的基因序列。統(tǒng)計結果顯示同源性序列最多的前五大物種均屬鱗翅目，表明拼接結果可靠。隨后，將注釋所得基因再次利用GO、COG/KOG、KEGG數據庫進行深入注釋，發(fā)現849個基因參與到七條主要的發(fā)育通路，如Hippo、Notch與JAK2等發(fā)育關鍵基因。在基因表達水平分析中，兩兩比較菜粉蝶相鄰六個發(fā)育階段，發(fā)現從卵期到初孵幼蟲期的轉變基因表達水平顯著變化的基因最多；發(fā)現表皮蛋白基因的表達水平在菜粉蝶不同的發(fā)育階段變化尤其頻繁，共

4、有20余個表皮蛋白基因在任意的相鄰階段表達水平差異顯著，推測與菜粉蝶發(fā)育過程中的蛻皮調控機制有關；此外，在不同發(fā)育階段均鑒定到階段特異性表達的基因，這些基因可作為發(fā)育階段的分子標簽；最后，通過對熱激蛋白同源進化與表達共分析，顯示同源相近的Hsp基因具有相同或相近的表達模式。
　　針對smRNA序列，主要研究內容包括小RNA的比對注釋，保守與新miRNA成熟體的鑒定，miRNA前體序列的預測，與表達水平研究。篩選與質控獲得53,50

5、8,931條序列長度在18-24nt高質量reads，去冗余后為121,695條特異序列，78,316條特異序列分別注釋到非編碼RNA數據庫（NCBI和Rfam）的rRNA,tRNA,snRNA,snoRNA,siRNA,miRNA等序列。其中以rRNA占比最高，其次為tRNA和miRNA。初選為miRNA的序列再次比對到miRBase數據庫，并去除冗余后，鑒定到143條保守miRNA序列，其中54個miRNA具有前體序列。另外，鑒定到

6、21條新的成熟miRNA，其中18條含miRNA前體序列，3條pre-miRNA序列包含miRNA*。差異表達分析的結果顯示有78條成熟miRNA序列的表達水平在至少兩兩相鄰發(fā)育階段之間存在顯著性差異，且大部分出現在從卵期到初孵幼蟲期。
　　對于miRNA調控基因表達研究，主要內容包括靶基因預測、篩選參與發(fā)育代謝通路的靶基因與表達相關性分析。以拼接轉錄本為參考序列，應用RNAHybrid和miranda軟件分別預測出6,198和6

7、,959個潛在miRNA靶位點，涉及5,589個靶基因，這些靶基因均注釋到NR數據庫。此外，根據KEGG數據庫中與昆蟲發(fā)育相關的代謝通路以及差異表達的miRNA和靶基因表達量的高度負相關性（相關系數小于-0.8）推斷出可能與菜粉蝶的生長發(fā)育相關的20條miRNA序列與37個靶基因。
　　本論文通過RNA-seq技術首次獲得了對菜粉蝶發(fā)育轉錄組，這是鱗翅目昆蟲第一個非模式生物的發(fā)育轉錄組，獲得了具有完整編碼框的基因16500個，發(fā)現