珙桐CesA基因的克隆及在種子發(fā)育中的表達分析.pdf

1、珙桐又名鴿子樹，是我國特有的一級保護珍稀瀕危植物，第三紀古熱帶植物孑遺種，具有很高的學術研究價值和觀賞價值。其種子繁殖能力弱，自然更新困難，休眠期長，對生長環(huán)境要求苛刻。種子敗育嚴重是制約珙桐有性繁殖的重要原因之一，這種現(xiàn)象在許多木本植物中是普遍存在的。目前對于這種自發(fā)的種子敗育機制缺乏分子水平上的解釋。本實驗前期通過轉錄組測序，已建立珙桐果實和種子的unigene庫，以上述unigene庫作為參考序列，通過數(shù)字表達譜分析，在珙桐正常種

2、子和敗育種子中篩選出2361個差異表達基因。其中我們發(fā)現(xiàn)纖維素合酶基因（CesA）在敗育種子中較正常種子呈現(xiàn)一致的顯著上調(diào)表達。本實驗通過分析纖維素合酶基因在珙桐種子發(fā)育過程中的表達模式，結合纖維素含量的測定，初步研究了珙桐中纖維素合酶的活性變化規(guī)律及在種子發(fā)育過程中所行駛的功能。并進一步選擇了一個基因，通過對該基因的表達分析，克隆，蛋白表達和功能驗證進一步明確該基因的功能。本研究旨在挖掘珙桐基因資源，解析種子敗育的分子機制，為理解種子

3、自發(fā)敗育的生物學意義提供理論基礎。主要研究內(nèi)容如下:
　　1.珙桐纖維素合酶基因的轉錄組數(shù)據(jù)分析
　　在珙桐種子轉錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出14個纖維素合酶基因（CesA），共有22個轉錄本，在敗育種子中呈現(xiàn)一致的顯著上調(diào)表達。其中有7個基因在正常種子和敗育種子中表達差異顯著。
　　2.纖維素合酶基因的表達分析
　　qPCR檢測表明CesA基因在敗育種子中呈現(xiàn)一致的顯著上調(diào)表達，挑選4個在敗育種子中顯著上調(diào)的CesA基因

4、進行表達分析，結果表明它們表達模式相似，在敗育種子中表達量均顯著高于正常種子，且在正常種子發(fā)育后期上調(diào)表達。將表達差異最顯著的c43681.graph_c0基因在珙桐不同組織中進行表達分析，結果顯示c43681.graph_c0基因在花和果實等生殖器官中表達量較高，在葉和芽等營養(yǎng)器官中表達量較低，在敗育的種子中表達量最高。證明c43681.graph_c0基因在生殖器官中偏好表達。
　　3.c43681.graph_c0基因的克隆

5、及編碼產(chǎn)物特征分析
　　設計引物將序列c43681.graph_c0基因進行克隆獲得882 bp片段，經(jīng)序列分析，其編碼產(chǎn)物包含292個氨基酸，具有6個跨膜結構域，等電點為9.07，為堿性蛋白，與擬南芥纖維素合酶4號催化亞基同源性最高，含有在植物中特有的保守區(qū)域。
　　4.目標基因表達蛋白質(zhì)
　　將成功構建的pET28/CesA重組質(zhì)粒導入宿主大腸桿菌BL21中進行原核表達，使用SDS-PAGE電泳進行分析。通過對誘導