谷子和甘蔗C-,4-型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及其轉基因水稻光合效率的提高.pdf

1、水稻是我國重要的糧食作物之一，它是一種典型的C3植物。與其它C3作物不一樣的是，水稻的生長需要相對較高的溫度和充足的陽光照射。然而高溫和高光強的生長環(huán)境更加適合于C4植物的生長，更加有利于發(fā)揮C4植物高光合效率的特點。因此本論文希望將C4植物中固定CO2的酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因導入水稻，獲得一種更加適合高溫和高光強生活環(huán)境的“C4型”水稻，這對于提高水稻的產量，滿足人口增長對糧食需求具有重大意義。
　　 本論文從C4植物谷

2、子和甘蔗中克隆了其C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶cDNA基因，獲得了具有自主知識產權的基因克隆，并將它們導入粳稻品種中花8號，進而對轉基因材料的光合生理特性進行了研究。結果如下：
　　 首次從谷子中得到了ppc基因兩個cDNA克隆，分別命名為Mppc1和Mppc2。前者是一個C3型的ppc基因，它可能屬于在根中特異表達的C3-2型ppc基因；后者是在綠色葉片中大量表達的C4型ppc基因。它們所編碼的蛋白的氨基酸殘基數(shù)分別為961和

3、964，序列同源性為82.5％。C4型PEPC多出的3個氨基酸位于N末端。利用RACE的方法我們得到了谷子C4型ppc基因完整的cDNA序列，包括63bp的5'非編碼區(qū)，2895bp的編碼區(qū)和256bp的3'非編碼區(qū)。
　　 首次獲得了甘蔗C4型ppc基因完整的cDNA序列的克隆，命名為Sppc。它包括95bp的5’非編碼區(qū)、2886bp的編碼區(qū)，和224bp的3'非編碼區(qū)。
　　 利用所克隆的基因，分別連上強組成型啟動

4、子Ubiquitin啟動子和強光調控啟動子Rubisco小亞基啟動子后，再插入兩個標記基因不同的表達載體pCB和pPCB的多克隆位點中，構建了八個含有外源ppc基因的植物表達載體pCB-Pubi-Mppc、pCB-Pubi-Sppc、pCB-PrbcS-Mppc、pCB-PrbcS-Sppc、pPCB-Pubi-Mppc、pPCB-Pubi-Sppc、pPCB-PrbcS-Mppc和pPCB-PrbcS-Sppc。再加上含有玉米完整的C

5、4型ppc核基因的載體pCB-ZMppc，共有9個載體。利用農桿菌介導法進行了水稻的轉化，各個載體都獲得了大量的轉基因植株。對標記基因潮霉素磷酸轉移酶基因hpt和磷酸甘露糖異構酶基因pmi以及導入的目的ppc基因的PCR擴增檢測，結果顯示絕大多數(shù)轉基因植株都能擴增出目的片段，而未轉化的植株則沒有擴增產物。對部分轉基因水稻的Southern和Western雜交以及RT-PCR分析都表明，無論從DNA水平、mRNA水平，還是從蛋白質水平上都

6、證明外源ppc基因都成功地導入了水稻，并獲得了正確的表達。
　　 對各載體轉基因植株PEPC活性大規(guī)模的測定表明，轉入玉米完整C4型PEPC核基因(有內含子)的水稻表現(xiàn)出極大的表達效率，大多數(shù)轉基因材料的PEPC活性為對照的10-20倍，其活性最高可達到對照的44倍。轉入谷子和甘蔗PEPC基因cDNA的水稻，表達的效率很低，多數(shù)材料活性增加僅為對照的2-5倍，但也有極少數(shù)材料活性增加了10倍以上。用Rubisco小亞基啟動子控制

7、的ppc基因在水稻的表達活性要略高于Ubiquitin啟動子控制的ppc基因。以上結果說明ppc基因的內含子在其轉錄或mRNA的穩(wěn)定上起著重要作用。
　　 對部分轉基因材料氣體交換特征的研究發(fā)現(xiàn)，隨著轉基因水稻PEPC活性的增加，凈光合速率也有逐漸增加的趨勢。其中PEPC活性最大的ZM24株系的三個單株凈光合速率比對照增加了39.8％、13.7％和28.6％，而它們的PEPC活性比對照分別增加了21.2、21.9和23.6倍。<