中國紅豆杉中新的羥化酶基因克隆與功能分析.pdf

1、紫杉醇是一種具有強大抗癌功效的萜類化合物，在紅豆杉中含量極低。目前主要利用半合成、天然產物提取獲得，市場供需矛盾激烈。基于合成生物學理念的異源生物合成是實現(xiàn)紫杉醇高量生產的途徑之一，但其前提是徹底解析目標產物的代謝途徑。羥化酶的克隆與羥化次序的確定是紫杉醇生物合成途徑研究的熱點和難點。本研究擬克隆中國紅豆杉中新的羥化酶，并對其功能進行分析，取得以下結果：
　　(1)中國紅豆杉中新的羥化酶的克隆與分析。對實驗室前期測定的紅豆杉轉錄組

2、數(shù)據(jù)進行分析，共發(fā)現(xiàn)了266個細胞色素P450酶基因序列片段，其中歸屬于CYP716和CYP725亞家族的基因片段39個。對其中4個包含完整的ORF的候選基因（cyp1，cyp2，cyp3，cyp4）進行了克隆，并對其同源性進行了分析，發(fā)現(xiàn)CYP1與來源于美國西加云杉的CYPA1同源性為71％，CYP2，CYP3，與 T10H的同源性分別為70%，74%，CYP4與煙草中的CYP716B1同源性為45%。
　　(2)4個候選羥化酶

3、基因（cyp1，cyp2，cyp3，cyp4）的原核表達。將4個候選羥化酶基因利用合適的酶切位點分別構建至原核表達載體pET-32a?？疾炝薎P TG濃度、誘導溫度、誘導時間等對蛋白表達的影響。結果表明，最佳誘導條件為：IP TG濃度0.08 mM，誘導時長5 h，溫度20℃，誘導表達的蛋白以包涵體形式存在。
　　(3）分別采用CO差光法和羥化酶體外反應體系對表達的羥化酶蛋白活性和功能進行分析。發(fā)現(xiàn)CYP2蛋白在CO吹泡后在450