桑疫病原菌拮抗性桑樹內生菌的篩選鑒定及其抑菌活性物質研究.pdf

1、桑疫病是由丁香假單胞菌桑致病性變種(Pseudomonas syringae pv.mori)引起的桑細菌性疾病。根據(jù)發(fā)病癥狀可將桑疫病分為斷柄型、縮葉型、黑枯型，該病在全國各桑樹栽培地區(qū)普遍發(fā)生，給蠶農帶來極大的經(jīng)濟損失。目前，桑疫病的防治主要依賴化學農藥，然而化學農藥不僅造成環(huán)境污染，同時農藥殘留給養(yǎng)蠶業(yè)帶來的負面影響也日益凸顯。利用桑樹內生菌進行桑疫病的生物防治是近年來備受關注的植病防治新策略，它可以減少桑樹病害，促進蠶桑產業(yè)發(fā)展

2、，并能與環(huán)境和諧相處。
　　本研究從健康桑樹中篩選、鑒定對桑疫病菌拮抗作用穩(wěn)定而顯著的內生菌。優(yōu)化生防內生菌產生抑菌活性物質的發(fā)酵條件，分離純化活性發(fā)酵液中的主要抑菌活性成分，為利用桑樹內生菌進行桑樹病害的生物防治及抑菌機制的深入探究奠定前期研究基礎，本研究主要取得了以下研究結果:
　　1.內生拮抗菌的分離、篩選及鑒定
　　從健康桑樹（桐鄉(xiāng)青）中分離獲得77個內生菌分離株，其中SWg2菌株對桑疫病菌表現(xiàn)出強而穩(wěn)定的拮抗

3、作用。該菌株經(jīng)傳代10次后，其發(fā)酵上清液仍然表現(xiàn)出很強的抑菌效果。對菌株進行了形態(tài)學特征觀察、生理生化試驗及基于16SrRNA的系統(tǒng)發(fā)育分析。結果顯示，SWg2菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，邊緣光滑整齊，革蘭氏染色為陰性，不具有芽孢，氧化酶試驗、產H2S試驗和亞硝酸鹽產氣試驗都呈陰性反應，能利用麥芽糖、果糖，不能利用乳糖和淀粉，葡萄糖發(fā)酵試驗(OF)表現(xiàn)為發(fā)酵型，該菌株可氧化分解多種單糖、多糖，并可利用其作為唯一的碳源;16S rR

4、NA基因序列分析顯示SWg2菌株與成團泛菌同源性達到98％以上，系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明其與已知菌株Pantoea agglomerans ATCC27993(FJ611872)處于同一最小分枝。綜合上述檢測結果，將桑樹內生拮抗菌SWg2鑒定為成團泛菌(P.agglomerans)，命名為成團泛菌SWg2。
　　2.內生拮抗菌SWg2菌株發(fā)酵條件優(yōu)化
　　利用單因素實驗與正交實驗對SWg2菌株發(fā)酵條件進行優(yōu)化，結果表明成團泛菌S

5、Wg2產抑菌活性物質發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源為甘油，氮源為NH4NO3，金屬離子為Mg2+，磷酸鹽為KH2PO4，發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH為7.5，裝瓶量為20％，培養(yǎng)溫度為28℃，轉速為170 r/min，種子液接種量為4.00％，培養(yǎng)時間為5d。正交試驗結果表明發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)組合為2.00％的甘油、2.00％的(NH4)2SO4、0.10％的KH2PO4和0.15％的MgSO4·7H2O。與馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基相比，利用優(yōu)化

6、后發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產的等量發(fā)酵上清液，其抑菌圈直徑分別提高了186.82％和215.18％。通過發(fā)酵條件優(yōu)化顯著提高了成團泛菌SWg2菌株抑菌活性物質的產量，為該菌株活性發(fā)酵液的大量生產及抑菌活性成分的分離純化奠定了基礎。
　　3.抑菌抑菌活性物質的理化性質的探究及活性成分的分離純化
　　抑菌活性物質的理化性質研究表明:主要抑菌活性成分易溶于乙醇、甲醇和乙腈，不溶于正丁醇、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯及石油醚等有機溶劑;抑菌成分

7、具有很好的熱穩(wěn)定性，活性發(fā)酵液經(jīng)100℃處理30 min后其抑菌活性未發(fā)生顯著變化;在pH3-6的環(huán)境中發(fā)酵上清液抑菌活性穩(wěn)定，當pH值高于6時，其抑菌活性急劇下降， pH＞9時抑菌活性物質完全失活?；趯σ志钚猿煞掷砘再|的掌握，設計純化方案，進行抑菌活性物質的分離純化。本研究首先利用無水乙醇沉淀去除發(fā)酵上清液中的雜蛋白，再將上清液濃縮為浸膏，乙腈浸提浸膏中抑菌活性成分后旋轉蒸發(fā)除去乙腈，提取物溶于pH5.8的Na2HPO4-檸檬酸

8、緩沖液。粗提物經(jīng)DEAE sepharose fast flow陰離子交換層析純化，在鹽離子濃度大約在0.13M-0.15 M處收集到主要抑菌活性成分。對發(fā)酵液上清液、乙腈浸提物以及離子交換分離獲得活性組分的最低抑制濃度(MIC)的檢測結果表明其分別為3.30×104μg/mL、6.20×103μg/mL和2.37×102μg/mL，經(jīng)離子交換層析以后，抑菌活性物質被純化了70余倍。將離子交換層析收集活性組分經(jīng)高效液相色譜C18柱純化，