漳州水仙開(kāi)花及花色基因植物表達(dá)載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、中國(guó)水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)屬石蒜科水仙屬，屬于法國(guó)多花水仙的變種，主要生產(chǎn)在上海、浙江、福建等地，其中以漳州水仙最有名，是、一類觀賞價(jià)值非常高的經(jīng)濟(jì)植物。三倍體的中國(guó)水仙，難以自然育種或是通過(guò)人工雜交產(chǎn)生新的品種。品種單一、繁殖速度有限、病毒積累導(dǎo)致品質(zhì)下降和品種退化等問(wèn)題已大大阻礙了中國(guó)水仙的發(fā)展。因此，開(kāi)展開(kāi)中國(guó)水仙新品種培育和品種改良的工作意義重大。隨著分子生物學(xué)的崛起和植物基因工程

2、等技術(shù)的發(fā)展，為中國(guó)水仙新品種的培育提供了新的方法。本研究以漳州水仙為材料，克隆出開(kāi)花時(shí)間調(diào)節(jié)基因 AP1、FT，并構(gòu)建了植物表達(dá)載體 pCAMBIA1301-NtFT、pCAMBIA1301-NtAP1、pC2300-35S-NtFT-OCS和pC2300-35S-NtAP1-OCS，以農(nóng)桿菌為介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草和漳州水仙，獲得了31株的轉(zhuǎn)基因煙草和3株抗性水仙幼苗。同時(shí)克隆出花色形成類黃酮代謝途徑中關(guān)鍵基因FLS和ANS，構(gòu)建了植物表達(dá)載

3、體pC2300-35S-NtANS-OCS、pBI121-FLS RNAi，并分別注射到水仙花瓣和副冠中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，觀察到水仙花瓣和副冠顏色均發(fā)生了變化。研究結(jié)果將為開(kāi)發(fā)中國(guó)水仙早花新品種和改良花色提供技術(shù)基礎(chǔ)和理論參考。
　　主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　1、提取漳州水仙花蕾和葉片的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以此為模板，根據(jù)已發(fā)表的水仙的FT、AP1、FLS、ANS基因的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)特異性引物，利用常規(guī)PCR技術(shù)分別克

4、隆出中國(guó)水仙中控制開(kāi)花時(shí)間的關(guān)鍵基因FT、AP1和類黃酮途徑中關(guān)鍵基因FLS、ANS。分別構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-NtFT、pCAMBIA1301-NtAP1、pC2300-35S-NtANS-OCS、pC2300-35S-NtFT-OCS、pC2300-35S-NtAP1-OCS和pBI121-FLSRNAi。農(nóng)桿菌介導(dǎo)構(gòu)建好的pC2300-35S-NtFT-OCS和pC2300-35S-NtAP1-OCS載體轉(zhuǎn)化到

5、煙草中，pCAMBIA1301-NtFT和pCAMBIA1301-NtAP1載體轉(zhuǎn)化到漳州水仙中。
　　2、以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的NtAP1和NtFT載體轉(zhuǎn)化煙草，獲得了轉(zhuǎn)基因煙草植株，用PCR和Real-time quantitative PCR進(jìn)行了檢測(cè)，證明所獲得植株為轉(zhuǎn)基因植株。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草植株的花期均比非轉(zhuǎn)基因的要提前10天左右，在表型上發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株均比非轉(zhuǎn)基因植株瘦弱矮小。
　　3.以農(nóng)桿菌介導(dǎo)pCAMBIA1301

6、-NtFT和pCAMBIA1301-NtAP1載體轉(zhuǎn)化了漳州水仙，初步獲得了3株抗性幼苗。
　　4.首先用GUS基因建立漳州水仙花瓣和副冠中農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)體系，結(jié)果表明此方法可以應(yīng)用在水仙花瓣和副冠中。將構(gòu)建好的pC2300-35S-NtANS-OCS、pBl121-NtFLSRNAi和pSAK277-MdMYB10（本實(shí)驗(yàn)室保存）載體以農(nóng)桿菌介導(dǎo)導(dǎo)入漳州水仙的花瓣和副冠中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，初步觀察到水仙花瓣和副冠中顏色發(fā)生了