中國荷斯坦種公牛FAK基因調控區(qū)的遺傳變異鑒定及其與精液品質的關聯(lián)分析.pdf

1、在現(xiàn)代奶牛群體改良中，種公牛是影響奶牛群體遺傳品質的主要因素，其對奶牛群體遺傳進展的貢獻率高達70％以上。精液品質性狀是種公牛選育工作中最基本的一項衡量指標，受到多基因控制，而常規(guī)育種手段選育良種公牛效率低，因此結合分子生物學技術，篩選出影響種公牛精液品質的候選基因作為分子標記，通過分子標記輔助選擇育種，為未來定向選育高品質精液的種公牛提供參考。
　　粘著斑激酶（Focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是一類胞質非受體

2、蛋白酪氨酸激酶（PTKs），它在細胞信號轉導中發(fā)揮重要作用，它是胞內外信號出入的中樞，介導多條信號通路。FAK還參與精子的釋放和精子的獲能等過程，在機體睪丸中具有較高的表達量，據(jù)此推測FAK基因可能是影響種公牛精液品質的一個候選基因。因此本課題以218頭中國荷斯坦種公牛精液為樣本，通過PCR和DNA測序技術篩選FAK基因的5'側翼區(qū)和3'UTR區(qū)中的突變位點，運用SAS軟件統(tǒng)計分析這些突變位點與公牛精液品質的關系，通過實驗最終鑒定出功能

3、性的突變位點。
　　1、中國荷斯坦公牛FAK基因3'UTR SNP的鑒定及其與精液品質的關聯(lián)性分析
　　本實驗通過PCR和DNA測序技術對FAK基因的3'UTR區(qū)進行了SNPs位點的掃描，發(fā)現(xiàn)了1個SNP，即g.129462_129463insGAA。對該 g.129462_129463insgaa SNP位點與種公牛精液品質關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，野生基因型BB種公牛個體的射精量和鮮精密度顯著高于AA基因型種公牛。
　　2、3

4、'UTR SNP g.129462_129463insGAA對bta-miR-21調控FAK基因表達的影響
　　利用miRNA在線軟件預測與FAK基因3'UTR區(qū)域結合的miRNAs。結果表明FAK基因3'UTR上的突變位點g.129462_129463insGAA位于bta-miR-21的種子序列區(qū)，而且發(fā)現(xiàn)此SNP突變前后影響FAK基因和bta-miR-21的結合能力。為了更好的驗證分子標記g.129462_129463ins

5、GAA對bta-miR-21與FAK基因3'UTR片段結合能力的影響，利用細胞瞬時轉染實驗對上述預測結果進行了驗證。分別將含有突變型和野生型兩種基因型的FAK基因3'UTR片段連入 pMIR-ReportTM Luciferase報告載體中，與bta-miR-21真核表達載體共轉染MLTC-1細胞，通過雙熒光素報告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)，與 pMIR-REPORT Luciferase-FAK野生型重組質粒相比，bta-miR-21質粒與 pMI

6、R-REPORT Luciferase-FAK突變后的重組質粒共轉染可使細胞的熒光素酶活性下降。通過Q-PCR檢測g.129462_129463insGAA位點不同基因型個體中FAK mRNA的含量，結果發(fā)現(xiàn)，BB基因型個體中FAK mRNA的含量極顯著（P<0.01）高于AB基因型。上述的關聯(lián)分析也表明，BB基因型個體的射精量和鮮精密度顯著高于AA型種公牛，因此我們推測此SNP可能通過影響bta-miR-21與FAK基因3'UTR的結

7、合能力，影響FAK基因的表達量，從而影響精子的釋放。
　　3、中國荷斯坦公牛FAK基因的啟動子區(qū)SNP與精液品質的關聯(lián)性分析
　　啟動子作為基因必不可少的元件，可以影響基因轉錄的啟動和表達的強度。本研究利用生物信息學方法預測FAK基因的啟動子區(qū)，發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)一些序列可與各種轉錄因子結合，包括NFATC1，STAT1，STAT3，F(xiàn)OXP1，SOX18，SP1等，這些位點的存在可能涉及FAK基因的轉錄調控機制。設計引物擴增該預