豬鏈球菌2型表面蛋白Fhb與補體系統組分蛋白相互作用分子機制的研究.pdf

1、豬鏈球菌2型(Streptococcus suis serotype2,SS2)是近年來新發(fā)的一種重要的人獸共患病病原體,人經傷口感染豬鏈球菌后主要引起腦膜炎、心內膜炎、敗血癥和鏈球菌中毒性休克綜合征(STSS)等癥狀。目前,對于豬鏈球菌2型致病機制,尤其是豬鏈球菌2型在人血中如何逃逸補體介導的吞噬殺傷研究還不是很清楚。
　　補體作為天然免疫防御中的一個重要成分,是保護宿主免受外來病原體入侵的一個有力武器。補體激活是一種高度有序的

2、級聯反應,宿主體內補體激活有三條途徑:經典途徑;甘露糖結合凝集素途徑;替代途徑。這三條途徑都形成C3轉化酶,裂解C3產生活性補體成分C3b,大量的C3b分子與病原體結合是補體活化中的重要事件。大部分能夠引起侵襲性疾病的病原菌都得益于通過直接抑制C3b或招募H因子(human Factor H,hFH)來抑制其表面C3b的沉積和功能,進而抑制補體系統的活化和補體受體介導的吞噬。
　　實驗室前期研究發(fā)現豬鏈球菌2型毒力因子表面蛋白Fh

3、b（factor H-binding protein),能夠招募人血清中的補體負調節(jié)子hFH,抑制補體替代途徑的活化,從而增強豬鏈球菌在血中存活及抗吞噬的能力;并通過GST-pulldown技術篩選到Fhb除了結合hFH外,還能與補體蛋白C3b、C3d相互作用,但是他們之間相互作用的具體分子機制卻不是很清楚,Fhb與C3b的結合對宿主補體系統的影響有何作用也值得進一步研究。
　　本研究第一部分主要是驗證Fhb蛋白功能結構域Fhb-

4、Ⅲ*與補體蛋白hFH、C3b以及C3d的結合。通過基因工程重組表達,構建了以pET28a為載體的7個Fhb截短結構域蛋白(Fhb-Ⅰ45-344;Fhb-Ⅱ45-170;Fhb-Ⅲ171-344;Fhb-Ⅳ345-664;Fhb-Ⅴ345-483;Fhb-Ⅵ484-664;Fhb-Ⅲ*134-344)和4個敲除結構域蛋白△37(△134-170aa);△3(△171-344aa);△3N(△171-232aa);△3C(△233-344

5、aa),利用鎳親和層析純化獲得目的蛋白。采用ELISA,配體印跡和生物膜干涉(Biolayer Interferometry,BLI)的技術來驗證Fhb結合補體系統組分蛋白hFH、C3b、C3d,并確定了結合區(qū)域主要位于Fhb-Ⅲ*(134-344aa)。另外,通過生物膜干涉技術分析得出Fhb-Ⅲ*與hFH、C3b、C3d之間的親和力常數KD值分別為83.51nM,17.09nM,141.5nM.本部分還對hFH與Fhb-Ⅲ*的結合方式

6、進行了探索,結果顯示,隨著溶液中氯化鈉和乙二醇濃度的增加,hFH與Fhb-Ⅲ*的結合能力減弱,揭示hFH與Fhb-Ⅲ*之間的結合方式部分依賴于離子鍵的作用,更多的是疏水作用和靜電作用的聯合。
　　本研究第二部分內容為Fhb-Ⅲ*抑制補體激活機制的研究。首先利用穿梭質粒pAT18構建了將功能結構域Fhb-Ⅲ171-344敲除的缺失互補株CΔSsfhb-3,采用免疫熒光-激光掃描共聚焦顯微鏡觀察和免疫印跡的方法對Fhb蛋白進行定位,發(fā)

7、現Fhb不僅表達于豬鏈球菌2型的表面,在培養(yǎng)的上清中也可檢測到。然后,采用流式細胞術(fluorescence activated cell sorter,FACS)構建的人血清-豬鏈球菌相互作用模型,發(fā)現培養(yǎng)上清中的Fhb蛋白能夠明顯抑制突變株ΔSsfhb表面補體C3b/iC3b的沉積,加入重組表達的結構域蛋白驗證得到Fhb主要依賴于其功能結構域Fhb-Ⅲ*發(fā)揮作用。
　　綜上所述,本研究結果證實了Fhb通過其功能結構域Fhb-

8、Ⅲ*直接結合補體系統組分蛋白hFH、C3b、C3d,并能夠在培養(yǎng)上清中以分泌蛋白的形式發(fā)揮作用;表明Fhb蛋白的雙功能性,即(1)表達于菌體表面的Fhb蛋白通過結合血漿補體負調節(jié)子hFH,與C3b/C3d分子形成復合物,進而降解C3b分子,抑制補體激活替代途徑C3轉化酶的形成,從而逃避補體介導的殺傷作用。(2)菌體表面的Fhb蛋白在某種作用力的剪切下脫落到培養(yǎng)的上清中,暴露出活性區(qū)域Fhb-Ⅲ*,并通過這一活性區(qū)域直接結合血清中的C3b