二穗短柄草VERNALIZATION1基因功能及其直接下游靶基因分析.pdf

1、VERNALIZATION1（VRN1）為溫帶禾本科植物從營養(yǎng)生長進入生殖生長的關鍵性基因，對小麥的抽穗以及花器官的發(fā)育起重要作用。基于麥類植物的基因組相對較大，生長周期較長，遺傳轉化較困難等特點，目前對麥類植物VRN1基因的研究還比較少。作為溫帶禾本科中響應春化的關鍵基因，VRN1在整個開花調控網絡中的具體作用，VRN1、VRN2及FT三者在整個開花調控網絡中的上下游關系等一系列的分子機理尚未明確。
　　二穗短柄草與大麥、小麥等

2、重要的糧食作物親緣關系較近，是新型的溫帶禾本科模式植物。本研究主要以二穗短柄草生態(tài)型Bd21為材料。為探索二穗短柄草中VRN1的功能，我們克隆了二穗短柄草BdVRN1 cDNA，分別構建CaMV35S及ZmUbi啟動的VRN1過表達載體，并遺傳轉化野生型二穗短柄草。長日照條件下，強啟動子ZmUbi能夠導致植物極早開花，95％以上的組培苗在分化階段即可開花，且有些極早花植株葉片有向穗分化的趨勢。與野生型相比，CaMV35S啟動BdVRN1

3、過表達轉基因植株提前一到兩片葉開花。表明VRN1促進植物開花的程度與其表達量有密切關系。外源基因表達量越高，VRN1促進植物開花的效果越明顯，表現出的早花表型也越強烈。
　　為進一步探索VRN1的功能，本研究同樣做了短日照下ZmUbi啟動BdVRN1過表達實驗。短日照下過表達BdVRN1同樣能導致植物早開花。轉基因植株再生過程中，分化培養(yǎng)基上同樣會有早花植株出現。鑒于短日照條件下，內源性刀、VRN1等開花促進因子本底水平較低。與長

4、日照相比，轉基因植株早花表型稍弱，僅有5％左右的植株會出現剛剛分化即頂著穗長出的極早花表型。實驗結果表明無論長短日照下，VRN1都是植物控制開花的關鍵基因。
　　小麥VRN1m mavp突變體表現為永不開花，為進一步驗證二穗短柄草中VRN1的功能，本研究構建了BdVRN1 RNAi載體并遺傳轉化野生型二穗短柄草。根據不同的沉默效果，BdVRN1 RNAi轉基因株系表現出不同程度的晚花表型。開花葉片數在9～15片葉不等。BdVRN1

5、 RNAi沉默實驗表現出晚花表型，進一步證明了VRN1的確能夠促進植物開花，并進一步確定了其在植物開花調控中的關鍵作用。
　　長短日照下過表達BdVRN1均能導致植物出現早花表型，但對其早花花器官解剖分析，并未發(fā)現無明顯異常。這表明，VRN1的下游可能存在影響花器官發(fā)育的直接靶基因。為進一步探索控制開花的分子機理，我們檢測了轉基因植株中開花相關基因的表達量變化。在BdVRN1過表達及RNAi沉默轉基因植株中，我們檢測的開花相關基因

6、，尤其是FT的兩個同源基因，其表達量均無無發(fā)生太大變化。這表明，溫帶禾本科中FT可能位于VRN1的上游起作用，FT通過上調VRN1的表達來促進植物開花。
　　為尋找VRN1的直接下游靶基因，本研究構建了小標簽載體。過表達融合蛋白實驗表明，只有后端標記的BdVRN1-3xHA載體對VRN1功能影響不大，轉基因植株能出現早花表型。前端以及兩端標記的小標簽載體，過表達都無早花現象，他們影響了VRN1的功能，后續(xù)實驗不能使用。此外，本研究