基于Cre-LoxP系統(tǒng)的皮膚特異性表達Tβ4基因載體構建及轉(zhuǎn)基因細胞系篩選.pdf

1、毛發(fā)是皮膚的附屬物，哺乳動物毛發(fā)的生長要經(jīng)歷毛囊的發(fā)育和分化過程，這一調(diào)控過程涉及到許多的功能基因和生長因子的參與。通過轉(zhuǎn)基因技術，將外源功能基因通過核移植的方式轉(zhuǎn)入哺乳動物體內(nèi)，使其在皮膚特異性表達，促進毛發(fā)生長，優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動物已獲得成功。人們在利用轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品獲得利益的同時，也必須重視轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性問題，要解決這一問題，如何刪除標記基因是關鍵。本研究依據(jù)Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)的特異性敲除功能，將已經(jīng)構建好的皮膚特異性表達

2、Tβ4基因的載體中的標記基因，進行選擇性的刪除，增加其轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性。同時為轉(zhuǎn)基因絨山羊提供核供體。
　　首先構建中間表達載體pMD19T-K14-Tβ4-PolyA，再進一步引入Cre/LoxP基因敲除系統(tǒng)，采用PCR技術，以pDsRed2-1載體為模板，人工克隆CMV啟動子，構建皮膚特異性表達胸腺素β4的條件打靶載體pKT-L（功能元件順序K14-Tβ4-PolyA-LoxP-CDsRed-LoxP），采用脂質(zhì)體介導的方法

3、分別轉(zhuǎn)染內(nèi)蒙古白絨山羊胎兒及皮膚成纖維細胞，經(jīng)轉(zhuǎn)染后在熒光顯微鏡下觀察到發(fā)紅色熒光的細胞匯合度超過50％后，加入適量的G418篩選，經(jīng)過一周后，即可獲得穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因細胞克隆。PCR法驗證細胞基因組中外源基因是否整合，采用半定量RT-PCR法檢測Tβ4 mRNA在兩種細胞中的豐度，Western blot分別檢測這兩種細胞基因組中Tβ4蛋白的表達水平。
　　測序結果顯示，成功構建了皮膚特異性表達Tβ4基因的條件打靶載

4、體pKT-L，且載體的各元件:角蛋白14啟動子，Tβ4基因，PolyA，CMV啟動子，LoxP序列和紅色熒光蛋白均按正確的順序連接。應用PCR方法檢測到細胞內(nèi)基因組中外源Tβ4基因已成功整合。 RT-PCR半定量實驗中轉(zhuǎn)Tβ4基因的細胞基因組中Tβ4mRNA的表達顯著增加，Western blot表明轉(zhuǎn)Tβ4基因后細胞中蛋白的表達量也大大增加，且Tβ4 mRNA水平在皮膚成纖維細胞比在胎兒成纖維細胞中表達量更高，表明K14皮膚特異性啟動