油桐種仁不同發(fā)育時期表達蛋白質組學研究.pdf

1、油桐是原產我國的世界著名木本油料樹種，從其種子中提煉而出的桐油是一種性質優(yōu)良的干性油，廣泛應用于工業(yè)中，具有極高的出口價值。
　　 利用經典蛋白質組學研究方法成功構建出油桐種仁在這一發(fā)育過程中的蛋白質表達譜，最終可運用蛋白質表達譜從蛋白質水平對油桐種仁中脂肪酸代謝過程進行闡述。發(fā)現油桐種仁中油脂含量與參與脂肪酸代謝的蛋白表達情況密切相關，油脂含量是由一系列參與脂肪酸代謝的蛋白（酶）共同決定的;此外，油體的動態(tài)發(fā)育過程更加形象化的

2、體現了這一過程。論文為構建油桐種仁蛋白質表達譜從蛋白質水平理解其內油脂合成過程，對種仁蛋白質的提取、雙向電泳體系優(yōu)化、表達譜分析做了大量研究，得出研究結論如下:
　　 (1)分析了影響油桐種仁蛋白質提純的關鍵因素，篩選確定TCA-丙酮結合酚抽法為有效提取油桐種仁蛋白質。實驗結果表明種仁中的內含物對油桐種仁蛋白質提純影響顯著，采用TCA-丙酮結合酚抽法能針對油桐種仁中所富含的次生代謝物質如核酸、糖、酚類物質進行有效清除，故能制備出

3、濃度高達8.1μg/μL的蛋白質樣品;其次，SDS-PAGE實驗表明，TCA-丙酮結合酚抽法對種仁中的高、低分子量蛋白質有較強的提取能力;再次， TCA-丙酮結合酚抽法所制備的蛋白質樣品2-DE圖譜分辨率高、背景清晰。
　　 (2)成功構建出具有高穩(wěn)定性和高重復性的油桐種仁蛋白質雙向電泳體系。具體針對能影響油桐種仁蛋白質雙向電泳效果的蛋白質裂解液、上樣量、等電聚焦時間以及SDS-PAGE電泳的運行條件等因素，進行優(yōu)化對比實驗，確

4、定了各因素的最優(yōu)條件。成功構建的最優(yōu)油桐種仁蛋白質雙向電泳體系為:以TCA-丙酮結合酚抽法制各樣品后經過配方為7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4％ CHAPS、65 mmol/L DTT和2％ IPG buffer的裂解液裂解后，等電聚焦上樣700μg進行聚焦70000Vh能夠得到良好的分離效果。
　　 (3)研究發(fā)現油桐在花后130 d～160 d為其發(fā)育過程中油脂積累的關鍵時期。通過對油脂含量變化和種殼顏色變化將這一

5、時期劃分為3個不同的發(fā)育階段S1(130 d)、S2(145 d)和S3(160 d)。
　　 (4)在油桐種仁發(fā)育的3個不同階段中共發(fā)現有144個蛋白質發(fā)生了差異表達，并通過MALDI-TOF/MS/MS成功鑒定出其中76個，將其分為能量代謝(25％)、脂肪酸代謝(15.79％)、抗性(14.47％)、蛋白酶(11.84％)等11個功能類別。
　　 (5)研究發(fā)現能量代謝一直是油桐種仁發(fā)育過程中除了脂肪酸代謝之外的最主

6、要的生理代謝活動之一，TAC循環(huán)和糖酵解是其主要的代謝途徑。S29(Malate dehydrogenase，蘋果酸脫氫酶)的表達量隨著種仁發(fā)育而逐漸增加，表明TAC循環(huán)中的草酰乙酸再生速度得到提升，而草酰乙酸的再生過程是維持TAC循環(huán)持續(xù)進行的關鍵。S62（3-phosphoglycerate kinase，3-磷酸甘油酸激酶）表達隨著種仁發(fā)育而增加表明糖酵解代謝隨著發(fā)育而得到增強。研究發(fā)現多數參與脂肪酸代謝的蛋白質在3個時期中的表達

7、變化過程與種仁中油脂的積累速率變化相一致，均是拋物線的變化趨勢，峰值出現在S2時期。這一發(fā)現有助于成功從蛋白質水平對種仁中油脂積累變化進行闡述。RT-PCR對參與能量代謝、脂肪酸代謝的10個蛋白質的研究結果表明，基因水平上的表達變化趨勢與蛋白質水平的表達變化趨勢具有較高的相似性，表明質譜鑒定結果具有較高的可靠性;同時，RT-PCR結果也可得出上述(5)(6)的結論。
　　 (6)在不同的發(fā)育階段，油體有不同的細胞學特征。以此為基