喹賽多藥理與毒理活性成分篩選研究.pdf

1、喹賽多作為一種新型的飼料添加劑具有良好的促生長作用，與喹嗯啉類其它藥物相比，喹賽多毒性作用很低。喹賽多在體內可被代謝成多種化合物，其中主要代謝物有cy1、cy4、cy6、cy12。迄今為止，仍然不明確喹賽多與代謝物的活性大小。所以有必要對喹賽多及其代謝物的活性大小進行比較，進而篩選出活性化合物，這對理解喹賽多的藥理與毒理作用機理具有重要的意義。
　　 藥物活性化合物篩選指標的選擇成為實驗的關鍵，通過文獻調研并結合本實驗室對喹賽多

2、的實際研究進展情況，最終確定以EGF mRNA的表達作為喹賽多藥理活性成分篩選的指標;以化合物與細胞孵育后對細胞活力的影響作為喹賽多毒理活性成分的指標。
　　 1、喹賽多的藥理活性成分篩選。
　　 采用RT-qPCR技術，首先測定不同濃度的喹賽多與細胞孵育不同時間后EGF的表達，以篩選出喹賽多與細胞作用后EGF mRNA上調表達的最佳濃度與時間點。結果顯示，2μM喹賽多與細胞孵育1h后EGF mRNA的表達量與空白組相比

3、上調2倍。喹賽多代謝物與細胞孵育后EGF mRNA上調倍數(shù)不如喹賽多顯著，在所有代謝物中cy12對EGF的上調作用最明顯，達到了1.3倍，cy6其次，cy1最低。所以得出喹賽多及其代謝物藥理活性大小順序為:喹賽多、cy12、cy6、cy4、cy1。加入PI3K和Akt抑制劑后，EGF mRNA表達量有所下調，這說明EGF mRNA的表達受PI3K-Akt調控。與PI3K相比，Akt對EGF mRNA表達的影響更顯著。2μM喹賽多可上調F

4、OXO1和p53的表達，但上調倍數(shù)不明顯。當Akt受抑制后，F(xiàn)OXO1的表達顯著上調，同時p53表達顯著下調;當PI3K受抑制后FOXO1和p53表達變化均沒有抑制Akt后的變化顯著，這提示喹賽多激活的是Akt而不是PI3K。當加入ROS清除劑NAC后，喹賽多并不能使FOXO1和p53的表達發(fā)生顯著變化，這提示喹賽多可能通過代謝產生ROS從而激活Akt，喹賽多及其代謝物與細胞孵育后對Akt磷酸化水平測定結果顯示，喹賽多與其代謝物相比可明

5、顯促進p-Akt的表達。
　　 構效關系分析顯示，喹賽多N-O基團是喹賽多的活性基團，N-O基團的代謝決定著喹賽多的活性。N-O基團的代謝促進細胞ROS的產生，2μM喹賽多與細胞孵育后，ROS在15min左右即開始釋放增加，在60min左右釋放量達到最高。對細胞周期相關蛋白cyclin D1進行熒光定量測定顯示，喹賽多在2h左右即可引起cyclin D1表達上調，在8h左右上調倍數(shù)達到最大，western blot檢測結果顯示c

6、yclin D1在8h和12h表達量明顯升高。
　　 由以上結果我們推測，喹賽多可代謝產生ROS激活Akt，上調EGF的表達，促進細胞分裂周期相關蛋白的表達，從而促進細胞增殖，達到促生長效果。
　　 2、喹賽多毒理活性成分篩選。
　　 MTT實驗與LDH釋放檢測實驗結果顯示，100μM喹賽多及其代謝物均可產生較明顯的細胞毒性，喹賽多的細胞毒性明顯高于代謝物，以細胞毒性大小為指標確定喹賽多及其代謝物毒性大小順序為:

7、喹賽多、cy12、cy4、cy6、cy1，這提示喹賽多經(jīng)代謝后毒性降低。熒光定量結果顯示，EGF、FOXO1和p53的表達呈現(xiàn)很明顯的量效關系，EGF和FOXO1的表達隨著喹賽多濃度的增加而下降;p53的表達隨著喹賽多濃度的增加而上升。當Akt被抑制后，p53的表達顯著下調，F(xiàn)OXO1表達與空白組相比無明顯變化;當PI3K被抑制后，p53和FOXO1的變化沒有Akt抑制后的變化顯著。這提示毒理濃度下喹賽多使Akt而不是PI3K被過度激活

8、，western blot檢測結果顯示，喹賽多與Akt抑制劑共同孵育后，細胞p-Akt水平較高。
　　 毒理濃度下細胞ROS釋放測定結果顯示，喹賽多與其代謝物相比能明顯促進細胞ROS產生，20μM喹賽多即可顯著促進ROS釋放，且量效關系明顯。時效關系測定顯示，ROS釋放量隨著孵育時間的延長而升高，在90min時ROS釋放量達到最高，100μM喹賽多與其代謝物相比可明顯促進細胞凋亡。
　　 綜上所述，本研究選用了合適的指標

9、，分析了篩選指標的時效量效關系，比較了喹賽多及其代謝物的活性大小，最終確定N-O基團是喹賽多的活性基團，喹賽多的藥理與毒理活性高于代謝物，喹賽多代謝產生ROS劑量大小決定喹賽多活性，低劑量喹賽多濃度下，喹賽多代謝產生少量ROS，Akt被輕微激活，細胞氧化磷酸化作用加快，細胞分裂加快，喹賽多表現(xiàn)出促生長效應;高劑量喹賽多濃度下，喹賽多代謝產生大量ROS，Akt被過度激活，過度激活的Akt一方面使細胞線粒體負荷加重促使細胞產生更多ROS，另