番茄SlSGR1和SlNIP7基因的功能研究.pdf

1、果實成熟是一個高度程序化的生物過程，涉及到色素代謝、風味形成、信號轉導等諸多方面，大量的基因參與了這一過程。通過前期的研究，我們在番茄（Solanum lycopersicum）中克隆得到了兩個可能與果實成熟有關的基因——SlSGR1基因和SlNIP7基因。SlSGR1基因是我們從番茄滯綠突變體green flesh（gf）中分離得到的，其在gf中發(fā)生了單核苷酸突變。因其與水稻（Oryza sativa）SGR基因高度同源，故命名為Sl

2、SGR1基因。前期的Northern Blot結果表明SlSGR1基因的表達與果實成熟和葉片衰老特異相關，并受環(huán)境脅迫和乙烯信號的誘導。為了進一步闡明gf的突變機理和SlSGR1基因的生理功能，我們通過構建RNAi沉默載體以及農桿菌介導的植物轉基因，獲得了16株NPTII陽性轉基因番茄苗系。半定量RT-PCR結果表明其中有5株達到了對SlSGR1基因較好的沉默效果。這5株番茄苗系均表現(xiàn)出與gf一致的滯綠表型，衰老和黑暗處理均不能誘導其葉

3、片的黃化?？側~綠素的提取與測定結果表明，SlSGR1基因的沉默阻斷了葉綠素的正常降解過程。綜合上述實驗結果，我們認為gf中SlSGR1蛋白的錯義突變很可能是導致其滯綠表型的根本原因，而有功能的SlSGR1蛋白很可能是葉綠素正常降解所必需的。由于SlSGR1基因是一個與果實成熟和葉片衰老都特異相關的基因，我們通過5’端缺失技術和植物轉基因技術獲得了994bp、737bp、529bp、328bp以及152bpSlSGR1啟動子驅動的GUS報

4、告基因轉基因番茄苗系。然而半定量RT-PCR和GUS活性檢測結果表明，最長的994bp SlSGR1啟動子片段還不足以實現(xiàn)對GUS報告基因的正常調控。這說明SlSGR1啟動子與衰老和成熟相關的核心元件可能還位于-994bp的上游。
　　SlNIP7（NR interaction protein 7）是我們通過酵母雙雜交技術，篩選得到的可能與成熟特異相關乙烯受體SlETR3（NR）互作的蛋白質。其編碼基因CDS區(qū)全長234bp，編碼

5、77個氨基酸殘基。定量Real-time RT-PCR結果表明，SlNIP7基因在番茄的各個器官和各個發(fā)育時期均有一定的表達，但表達量以花器官居高。此外，SlNIP7基因的表達在果實成熟后期有顯著上調，但這種上調趨勢在乙烯不敏感突變體Nr（Never ripe）和果實不成熟突變體rin（ripening inhibitor）中受到了明顯的抑制。與果實成熟過程中的上調趨勢不同，SlNIP7基因的表達隨葉片的衰老進程而下調。農桿菌介導的對野

6、生型番茄SlNIP7基因的超表達和沉默并沒有影響成熟果實的外在表型以及相關Marker基因（PSY1、PG、TomLoxB、ACO3、ACS2、E4、E8以及ERF1）的表達水平。這表明SlNIP7蛋白很可能并不參與乙烯信號的轉導，而更可能受到了乙烯信號的調控，這種調控的生理學意義可能在果實成熟范疇之外。接下來的抗性實驗表明，SlNIP7沉默轉基因苗系在干燥環(huán)境下較野生型有著更好的生長狀況。這暗示SlNIP7基因的表達水平可能與植株對干

7、燥的抗性有關。轉基因苗系在生理和分子水平的諸多表現(xiàn)使我們萌生對SlNIP7-NR互作關系的質疑，全新的酵母雙雜交實驗肯定我們對互作關系假陽性的猜想。然而，基于SlNIP7沉默轉基因苗系對干燥環(huán)境的較好抗性，進一步深入研究SlNIP7基因的功能還是有一定意義的，而對于其命名還有待商榷。
　　此外，在我們的轉基因后代中，有兩個株系表現(xiàn)出純合狀態(tài)下的卡那霉素敏感性以及雜合狀態(tài)下的卡那霉素抗性。Northern Blot表明，NPTII標

8、記基因在純合后代中受到了沉默，而在雜合后代中能夠正常表達。因此，我們將這一現(xiàn)象命名為純合子依賴型協(xié)同抑制。small RNA檢測結果表明，NPTII同源small RNA廣泛存在于轉基因后代中，但其在純合后代中的豐度要明顯高于雜合后代。為了闡明small RNA產生的分子機制，我們檢測了轉基因植物中的通讀轉錄產物（read-through transcripts），結果發(fā)現(xiàn)只有CaMV35S啟動子驅動下的含反義NPTII片段的通讀RNA

9、存在于轉基因植物中。結合這一實驗結果，我們推測：通讀RNA很可能與正義NPTII mRNA配對形成擁有部分雙鏈結構的dsRNA，并在Dicer酶的作用下水解為siRNA；如果植株是在雜合狀態(tài)，通讀RNA不能達到閥值水平，只有少量的dsRNA和siRNAs形成；如果植株是在純合狀態(tài)，通讀RNA會超過閥值水平并有效形成大量的dsRNA和siRNAs；這些siRNAs隨后作為信號分子介導了NPTII基因mRNA的降解，并最終導致了NPTII基