四個(gè)玉米及其野生材料BAC基因組文庫(kù)的構(gòu)建和分析.pdf

1、玉米是世界上最重要的農(nóng)作物之一，它不但為人類(lèi)提供食物，同時(shí)也是優(yōu)質(zhì)的飼料，更是多種工業(yè)制品如酒精，淀粉的原料。育種家更是培育出了眾多特用玉米，大大擴(kuò)展了玉米的用途。遺傳學(xué)和基因組學(xué)中的很多現(xiàn)象如轉(zhuǎn)座子，表觀遺傳和雜種優(yōu)勢(shì)等都首先在玉米中被發(fā)現(xiàn)。玉米的基因組表現(xiàn)出復(fù)雜和多樣化的特點(diǎn)，是其它大型植物基因組測(cè)序和基因組進(jìn)化的模式植物。世界上玉米的種質(zhì)資源非常豐富，它們的野生近緣材料，大芻草和摩擦禾更是包含眾多優(yōu)良性狀及生物和非生物抗性的基因?qū)?/p>

2、庫(kù)。開(kāi)發(fā)和解讀玉米及其野生材料的基因組資源的第一步是構(gòu)建大片段基因組的細(xì)菌人工染色體文庫(kù)(bacterialartificialchromosomelibrary,BACLibrary)，構(gòu)建高質(zhì)量的物理圖譜，進(jìn)而得到全基因組序列。還可以同時(shí)將篩選到的包含重要農(nóng)藝性狀基因或基因家族的大片段直接進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化來(lái)研究基因的功能。考慮到開(kāi)發(fā)玉米及其野生資源的重要性以及BAC文庫(kù)在基因組學(xué)研究中的重要作用，本研究構(gòu)建了四個(gè)玉米及其野生材料的BAC

3、文庫(kù)，并對(duì)這些文庫(kù)進(jìn)行了質(zhì)量檢測(cè)。對(duì)兩個(gè)野生玉米材料進(jìn)行了初步分析。
　　四個(gè)玉米及其野生材料分別是自交系鄭58和昌7-2，大芻草Parviglumis(Zeamaysssp:Parviglumis)，摩擦禾Tripsacum（Tripsacumdactyloides）。鄭58和昌7-2是中國(guó)種植面積最廣的雜交種鄭單958的雙親，包含了眾多優(yōu)良農(nóng)藝性狀基因。Parviglumis是栽培玉米的祖先，TripsacumL.在玉蜀黍族里

4、面距離玉蜀黍?qū)儆H緣關(guān)系最近，也和玉米的起源有關(guān)。Parviglumis和Tripsacum都是巨大的基因?qū)殠?kù)，它們代表著還未開(kāi)發(fā)的與農(nóng)作物改良相關(guān)的遺傳資源。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)以上四種材料的研究結(jié)果如下:
　　1.構(gòu)建了兩個(gè)玉米自交系（鄭58和昌7-2）以及兩個(gè)玉米野生材料（Parviglumis和Tripsacum）的BAC文庫(kù)。這四個(gè)BAC文庫(kù)都是用HindⅢ部分酶解，連接到pIndigoBAC536-SBAC載體上。鄭58的BAC文

5、庫(kù)包含148，992個(gè)克隆，平均插入片段為144kb，細(xì)胞器DNA污染率為0.55％，基因組覆蓋度為8.4倍。昌7-2的BAC文庫(kù)包含145，920個(gè)克隆，平均插入片段為139kb，細(xì)胞器DNA污染率為0.58％，基因組覆蓋度為8.0倍。Parviglumis的BAC文庫(kù)包含100，608個(gè)克隆，平均插入片段為148kb，細(xì)胞器DNA污染率為0.31％，基因組覆蓋度為5.5倍。Tripsacum的BAC文庫(kù)包含128，256個(gè)克隆，平均

6、插入片段為139kb，細(xì)胞器DNA污染率為0.26％，基因組覆蓋度為4.7倍。
　　2.選擇了12個(gè)玉米B73的單拷貝基因，分別分布在玉米的10條染色體上。用該12個(gè)基因作探針，對(duì)Parviglumis和TripsacumBAC文庫(kù)進(jìn)行篩選。12個(gè)基因在兩個(gè)野生玉米BAC文庫(kù)中都篩選到了陽(yáng)性克隆，說(shuō)明這兩個(gè)野生玉米文庫(kù)可以用來(lái)篩選目的基因。兩個(gè)玉米自交系鄭58和昌7-2的BAC文庫(kù)因?yàn)閾碛懈叩幕蚪M覆蓋度，篩選到目的基因的可能性

7、更大。
　　3.對(duì)4個(gè)位點(diǎn)，adh1，adh2，tb1，ba1上下游基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用這些基因探針對(duì)Parviglumis和TripsacumBAC文庫(kù)進(jìn)行篩選。一共篩選到120個(gè)克?。≒arviglumis）和159個(gè)克隆（Tripsacum）。對(duì)這些克隆通過(guò)fingerprinting進(jìn)行contig拼裝，以備后續(xù)測(cè)序分析。
　　4.對(duì)來(lái)自?xún)蓚€(gè)野生玉米文庫(kù)的442個(gè)克隆進(jìn)行末端測(cè)序，有88％的末端序列測(cè)序成功。對(duì)1

8、2個(gè)基因探針篩選到的陽(yáng)性克隆通過(guò)fingerprinting進(jìn)行contig拼裝。Parviglumis文庫(kù)中共有64個(gè)克隆拼裝成了20個(gè)contigs，Tripsacum文庫(kù)中共有85個(gè)克隆拼裝成了27個(gè)contigs。用一個(gè)contig表示一個(gè)位點(diǎn)來(lái)估算基因組的覆蓋度，ParviglumisBAC文庫(kù)的基因組覆蓋度為3.2倍，而TripsacumBAC文庫(kù)的基因組覆蓋度為3.1倍。
　　5.我們嘗試?yán)肂AC末端序列將Parv

9、iglumisBAC文庫(kù)中篩選到的陽(yáng)性克隆錨定到玉米B73的參考序列上。Parviglumis中有102個(gè)克隆的BESs在B73參考序列上有錨定位點(diǎn)。成功測(cè)得202條BESs，有196條BESs在B73參考序列上有錨定位點(diǎn)。有70個(gè)克隆可以錨定到參考序列上。其中有18個(gè)克隆能夠拼裝成contig，并且錨定到預(yù)期的位置。一共有9個(gè)contig可以錨定到參考序列上。
　　6.我們嘗試?yán)肂AC末端序列將TripsacumBAC文庫(kù)中篩

10、選到的陽(yáng)性克隆錨定到玉米B73參考序列上。Tripsacum中有104個(gè)克隆的BESs在B73參考序列上有錨定位點(diǎn)。成功測(cè)得229條BESs，有150條BESs在B73參考序列上有錨定位點(diǎn)。有22個(gè)克隆可以錨定到參考序列上。其中有5個(gè)克隆能夠拼裝成contig，并且錨定到預(yù)期的位置。一共有3個(gè)contig可以錨定到參考序列上。
　　7.分析能夠錨定到B73參考序列上的adh1contig。通過(guò)用Ⅰ-SceⅠ酶切BAC克隆，用脈沖場(chǎng)