煙草根黑腐病菌Thielaviopsis basicola致病力分化與遺傳多樣性研究.pdf

1、煙草根黑腐病是世界性煙草病害，其病原菌為根串珠霉Thielaviopsis basicola(Berk.& Br.)Ferr.，該菌寄主范圍廣泛，可為害多種重要的農作物。關于該病菌形態(tài)及分子遺傳多樣性研究方面國內未見深入系統(tǒng)報道，為明確我國不同煙區(qū)煙草根黑腐病菌形態(tài)、致病力及分子遺傳多樣性，本論文開展了以下幾方面研究：
　　 (1)對我國云南、甘肅、貴州、重慶和河南5個主要產煙省(市)煙草根黑腐病樣品進行病原分離，按照柯赫氏法則

2、對得到的病原菌進行致病性測定，結合其形態(tài)特征及rDNA-ITS分子方法鑒定其所屬種。
　　 (2)測定了不同菌株菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響因子。
　　 (3)對各地代表性菌株進行致病力差異測定，并比較了7個煙草主栽品種的室內抗性水平。
　　 (4)詳細觀測所有菌株在V8培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和厚垣孢子特征，參照Punja&Sun的培養(yǎng)方法和分群鑒定依據對其進行分群鑒定。
　　 (5)利用ISSR-PCR標記技術

3、對86株來自煙草和胡蘿卜的根串珠霉菌株進行分子遺傳多樣性分析。
　　 (6)利用顯微及超微技術探究病原菌的侵染機理。結果表明：
　　 1.從我國云南、甘肅、貴州、重慶和河南5省(市)不同煙區(qū)采集具有典型根黑腐癥狀的煙草病害樣本及病根處土壤，用改進的胡蘿卜圓片法分離病原菌，共得到45個野生型單孢分離菌株，柯赫氏法則證病結果顯示這些菌株均為該病的致病菌，另有13株白色變異型菌株為野生型菌株室內培養(yǎng)時產生。形態(tài)學及rDNA-I

4、TS分子鑒定結果均顯示：所有菌株包括兩株來自胡蘿卜的參試菌株，在分類上均為根串珠霉Thielaviopsis basicola(Berk.& Br.)Ferr.。病菌rDNA-ITS序列分析結果顯示，白色變異型菌株與其野生型菌株序列一致，不同寄主來源根串珠霉rDNA-ITS序列有差異。
　　 2.選取菌落形態(tài)不同的菌株CPW1-1、CWH-1和HLL-1’，測定影響其菌絲生長和孢子萌發(fā)的培養(yǎng)因子。結果表明：在Czapek培養(yǎng)基上

5、HLL-1’不生長，CPW1-1和CWH-1可緩慢擴展形成稀薄疏松的菌落，供試培養(yǎng)基中最適合三者生長的分別為PDA、PSA和PCA。溫度對供試菌株菌絲生長有明顯影響。3個菌株在5℃～35℃間均能生長，最適溫度均為25℃。供試菌株在pH=4～12范圍內均能生長，CPW1-1、CWH-1和HLL-1’分別在pH=7、pH=10和pH=6時菌絲生長速度最快，在培養(yǎng)基偏酸或偏堿時，CPW1-1菌落易產生白色扇狀變異。除木糖外兩個野生型菌株都能有

6、效利用各種供試碳源，氮源中則是牛肉膏和酪氨酸的利用效果最好。相同光照或相同溫度條件下CPW1-1孢子萌發(fā)率均高于CWH-1，在有機營養(yǎng)存在時，情況則相反；黑暗條件有利于孢子萌發(fā)，CPW1-1、CWH-1和HLL-1’孢子萌發(fā)的最適溫度分別是20℃、15℃和20℃。
　　 3.采用傷根接種法對15個煙草根黑腐菌株進行致病力差異測定，并比較了7個煙草主栽品種的室內抗性水平。研究結果表明：供試的15株煙草根黑腐病菌引致的病害程度不一，

7、病情指數從19.2～62.5不等，致病力分化明顯，其中4株表現強致病力，中等致病力菌株10株，白色變異體HLL-1’為弱致病力菌株，野生型菌株中未發(fā)現弱致病力菌株。不同煙草品種對同一菌株的抗性差異大，可產生高感、感病、中抗和抗病等不同抗性反應；在供試的煙草品種中，貴煙4號、秦煙96和中煙100有較強的抗病性。
　　 4.參照Punja&Sun的分群鑒定方法，將來自煙草的45個野生型和13株白色變異型共58個根黑腐菌株進行了分群鑒

8、定。結果表明：我國煙草根黑腐病菌分離株存在明顯形態(tài)變異，共劃分出6個群，其中群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ為野生型，群Ⅳ、Ⅴ為白色變異型；另有白色變異型HLL-1’菌落平展白色，厚垣孢子簇生或單生，有瓶梗孢子產生，形態(tài)特征明顯不同于其它群，將其建為新群-群Ⅵ。群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ及Ⅵ的分離頻率分別占41.4％、32.8％、3.4％、19.0％、1.7％和1.7％。群莊要分布重慶和云南，群Ⅱ在五個采樣省(市)均有分布，群Ⅲ和群Ⅴ僅分布在貴州，群Ⅳ主要分布在

9、重慶、河南和云南。群Ⅵ僅在河南有分布。
　　 5.以煙草根黑腐病菌基因組DNA為模板，采用單因素水平優(yōu)化的方法對Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP和模板等的濃度，以及退火溫度等幾個因素進行優(yōu)化，建立了根串珠霉ISSR-PCR優(yōu)化反應體系，利用該體系從20個ISSR引物中篩選出6個多態(tài)性較好的ISSR引物，PCR擴增86個不同菌株后獲得大量清晰可重復的DNA指紋圖譜，其平均多態(tài)位點百分率為70.91％。供試總樣本的Shann

10、on多樣性指數I為0.5504，Nei’s指數h為0.3726，種群間的基因多樣度DST=0.1657，種群基因分化系數GST平均值為0.5405，大于0.5，表明供試種群具有較高的遺傳多樣性，不同寄主、不同地區(qū)來源根串珠霉存在著明顯的遺傳分化，聚類分析可將它們分成7個遺傳聚類群。
　　 6.分析以上幾個結果間的關系后發(fā)現，煙草根黑腐病原菌致病力分化與其培養(yǎng)特性、形態(tài)分群之間有明顯的相關性，ISSR標記揭示的遺傳聚類組群與菌株致