家蠶30K蛋白的鑒定和功能研究.pdf

1、家蠶是鱗翅目的模式昆蟲，具有開放式的血液循環(huán)系統(tǒng)。血液在家蠶的生命活動中承擔著重要的生理功能，它是體內各種營養(yǎng)物質和激素等的交換場所。家蠶的血液重量占整個體重的21％～25％，而血液蛋白質是血液的主要成分。家蠶30K蛋白是末齡幼蟲和蛹期血液中含量最大的一群蛋白質，也是胚胎中主要的卵黃蛋白。30K蛋白屬于鱗翅目昆蟲低分子量脂蛋白家族。到目前為止，已在家蠶、煙草天蛾和粟夜蛾三個物種中鑒定到了該家族的同源蛋白。
　　 家蠶9倍基因組的

2、組裝成功，以及各種鱗翅目昆蟲EST數據的公布，為系統(tǒng)性鑒定鱗翅目昆蟲低分子量脂蛋白家族的成員奠定了良好的基礎。本研究在此基礎上，對鱗翅目昆蟲的低分子量脂蛋白進行了鑒定，并對它們進行了結構分析和進化分析。此外，利用已公布的家蠶基因組和芯片數據，我們還對家蠶的低分子量脂蛋白基因進行了染色體定位分析、組織表達譜分析和發(fā)育時期表達譜分析。
　　 在獲得了以上數據的基礎上，本研究重點對家蠶低分子量脂蛋白家族中的典型30K蛋白亞家族進行了功

3、能研究。利用已經制備獲得的BmLP1和BmLP7的抗體，我們對30K蛋白基因的合成、分泌、轉運和利用等進行了系統(tǒng)性的研究。另外，本研究還從家蠶血液中純化獲得了幾種30K蛋白，利用氯仿和甲醇法提取了30K蛋白所結合的脂類，并進一步利用LC-MS/MS對30K蛋白所結合的脂類進行了質譜鑒定。
　　 本研究獲得的主要結果如下:
　　 1.鱗翅目昆蟲低分子量脂蛋白基因的鑒定
　　 (1)鱗翅目昆蟲低分子量脂蛋白基因的鑒定

4、:在家蠶基因組精細圖序列數據和各種鱗翅目昆蟲EST數據的基礎上，本研究對鱗翅目昆蟲的低分子量脂蛋白家族進行了鑒定。在蠶蛾總科、夜蛾總科和螟蛾總科的12個物種中，共鑒定到73個低分子量脂蛋白基因，它們的分布情況如下:家蠶46個、蓖麻蠶5個、琥珀蠶6個、印度柞蠶4個、煙草天蛾3個、草地貪夜蛾1個、粟夜蛾1個、西方豆類夜蛾1個、棉鈴蟲1個、甘藍夜蛾1個、粉紋夜蛾1個和豆莢野螟蛾1個。在鑒定獲得的73個基因中，有56個基因為首次鑒定。
　

5、　 (2)低分子量脂蛋白的結構分類:對鑒定到的基因進行序列比對，發(fā)現它們根據結構可以分為三個亞家族:典型30K蛋白（Typical30KP）、富含絲氨酸和蘇氨酸的30K蛋白(S/T-rich30KP)和ENF肽結合蛋白(ENF-BP)。這三個亞家族有著相似的C端序列，都由一個NTD和一個CTD組成，而它們的N端序列差別很大。典型30K蛋白的N端由信號肽和一段很短的不保守區(qū)域組成;S/T-rich30KP的N端則由信號肽和一個富含絲氨酸

6、和蘇氨酸的結構域(STD)組成;ENF肽結合蛋白的N端由一個惡臭假單胞菌同源區(qū)(PPD)組成。
　　 (3)低分子量脂蛋白的進化分析:在蠶蛾總科中，同時存在典型30K蛋白、富含絲氨酸和蘇氨酸的30K蛋白和ENF肽結合蛋白亞家族。但在夜蛾總科和螟蛾總科中，我們只鑒定到了ENF肽結合蛋白亞家族。并且，在全基因組已被測序的棉鈴蟲中，也只能鑒定到ENF肽結合蛋白亞家族。這些結果表明，ENF肽結合蛋白亞家族是三個亞家族中起源最早的一個亞家

7、族。富含絲氨酸和蘇氨酸的30K蛋白只在家蠶中鑒定到，可能為家蠶特有的一群低分子量脂蛋白。
　　 2.家蠶低分子量脂蛋白基因的特征分析
　　 (1)家蠶低分子量脂蛋白基因的染色體定位:家蠶中共鑒定到46個低分子量脂蛋白基因，其中的43個基因能定位到染色體上。Bmlp1～Bmlp32（24個典型30K蛋白基因和8個富含絲氨酸和蘇氨酸的30K蛋白基因）全部定位于第20號染色體的nscaf2795重疊群上的970Kbp(1380

8、K～2350K)區(qū)域內，它們在染色體上呈串聯重復分布。家蠶的10個ENF肽結合蛋白基因中，有8個基因構成了4個基因對(Bmlp37/38、Bmlp40/39、Bmlp41/42和Bmlp44/45)，定位于第7號、22號和24號染色體上，每個基因對內的2個基因的轉錄方向相反。
　　 (2)家蠶低分子量脂蛋白基因的表達特征分析:家蠶中的三群低分子量脂蛋白基因的組織和時期表達特征各不相同，暗示它們存在功能的分化。典型30K蛋白基因主

9、要在脂肪體和體壁中表達，部分30K蛋白基因在一齡到四齡幼蟲期表達，部分在五齡幼蟲到蛾期表達。ENF肽結合蛋白基因主要在血細胞中表達，可能參與了血細胞的免疫調控過程。富含絲氨酸和蘇氨酸的30K蛋白基因主要在羽化前一天和化蛾第一天有表達，在精巢中的表達量很高，而在卵巢中幾乎不表達。根據其富含絲氨酸和蘇氨酸的特征，推測可能參與受精或者精子的形成過程。
　　 3.家蠶30K蛋白的合成、分泌、轉運和利用
　　 (1)家蠶30K蛋白

10、的合成和分泌:通過RT-PCR技術分析不同發(fā)育時期脂肪體中30K蛋白基因的合成模式。同時，通過westemblotting技術對不同發(fā)育時期血液中30K蛋白的變化情況進行分析。綜合以上兩方面結果，表明30K蛋白是由脂肪體合成，然后分泌入血液。
　　 (2)家蠶30K蛋白的轉運:在蛹期和蛾期時，血液中的30K蛋白逐漸減少，而卵巢中的30K蛋白卻逐漸增加。RT-PCR結果表明，卵巢中的30K蛋白并非自身合成而來。因此，卵巢中的30K

11、蛋白可能是從血液中轉運而來。通過制備30K蛋白親和柱，對卵巢膜蛋白進行pull-down實驗，發(fā)現卵黃原蛋白受體能與30K蛋白結合，因此推測卵黃原蛋白受體可能是介導30K蛋白轉運的受體。免疫組織化學定位結果表明，30K蛋白主要轉運進卵巢的卵母細胞內儲存起來。
　　 (3)家蠶30K蛋白的利用:對不同發(fā)育時期的胚胎蛋白質進行westernblotting分析，發(fā)現30K蛋白主要在胚胎的最后兩天減少。對不同發(fā)育時期的胚胎進行酶活分析

12、，發(fā)現酶活從胚胎第5天后升高，到蟻蠶時達到最大值。提取蟻蠶粗提物，并與30K蛋白進行體外孵育，發(fā)現蟻蠶粗提物能夠降解30K蛋白。對第6天和第10天的胚胎進行免疫組織化學定位，結果表明30K蛋白在胚胎早期主要定位于胚外的卵黃顆粒中，在胚胎后期定位于胚子的腸腔內。綜合以上結果，發(fā)現30K蛋白在反轉期前定位于胚外卵黃顆粒中，反轉期后由胚子吞入腸腔內，再由腸腔內的蛋白酶對30K蛋白進行降解，為蟻蠶的孵化提供能量來源。
　　 4.家蠶30

13、K蛋白的純化及其結合脂類的鑒定
　　 (1)30K蛋白的純化:通過硫酸銨沉淀、疏水作用層析和陽離子交換層析成功地從家蠶五齡第7天血液中純化到BmLP1、BmLP7、含2種30K蛋白的組分和含4種30K蛋白的組分。
　　 (2)30K蛋白載脂功能的驗證:對純化的30K蛋白進行SDS-PAGE電泳，并用油紅O染色法染色，結果表明純化得到的30K蛋白含有脂類，表明30K蛋白具有載脂功能。
　　 (3)30K蛋白所結合脂

14、類的鑒定:采用氯仿和甲醇法提取30K蛋白所結合的脂類，并用LC-MS/MS進行鑒定。共鑒定到12種含量較高的脂類，其中分子式為C22H35O6、C25H31O8和C12H13O4的脂類較多，尤以分子式為C25H31O8的脂類最多，且該脂類含有多個同分異構體。但是，由于這些脂類分子結構較穩(wěn)定，質譜碎裂時無法得到它們的結構信息，因而目前無法推測它們的結構式，需要進一步實驗對其結構式進行鑒定。
　　 (4)胚胎中脂類的利用:利用薄層層

15、析方法對不同發(fā)育時期胚胎中的脂類進行分離，結果顯示脂類主要在胚胎后期被消化吸收，而30K蛋白也是在胚胎后期被利用。因此，我們認為在胚胎利用30K蛋白的同時，30K蛋白所結合的脂類也一起被胚胎利用。
　　 綜合第3和第4點的結果，我們對家蠶30K蛋白的功能有了進一步的認識。從五齡期到上蔟期，幾個30K蛋白基因（Bmlp1～Bmlp4，Bmlp7）在家蠶脂肪體中高量表達，之后分泌入家蠶血液中。在五齡末期的血液中30K蛋白含量最大，之