中華絨螯蟹卵黃蛋白原cDNA序列的克隆和表達(dá)量分析.pdf

1、卵黃蛋白(vitellin,簡(jiǎn)稱(chēng)Vn)是所有卵生的脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物雌性卵黃的主要成分,是一種高密度糖脂蛋白,是胚胎和幼體早期發(fā)育主要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源,并具有攜帶轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪的功能。主要是外源合成的前體分子--卵黃蛋白原(Vitellogenin,Vg)修飾而來(lái),是卵生長(zhǎng)發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。近年來(lái),甲殼動(dòng)物Vg合成位點(diǎn)以及表達(dá)量變化的研究成為了熱點(diǎn)。目前,在經(jīng)濟(jì)類(lèi)甲殼動(dòng)物中,卵黃蛋白原的研究主要集中在蝦類(lèi),關(guān)于蟹類(lèi)的并不多見(jiàn)。中華絨螯蟹(Erioc

2、heirsinensis)作為我國(guó)最重要的經(jīng)濟(jì)甲殼類(lèi)之一,其卵黃蛋白的合成、集聚、多寡、分布等等對(duì)其胚胎和幼體至關(guān)重要。而關(guān)于中華絨螯蟹卵黃蛋白的相關(guān)報(bào)道多停留在卵黃的形成和發(fā)生的形態(tài)學(xué)觀察,對(duì)于其cDNA序列及其結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和功能分析以及表達(dá)研究則尚未見(jiàn)報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)選擇中華絨螯蟹為研究對(duì)象,旨在克隆中華絨螯蟹卵黃蛋白原基因cDNA全序列和對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析,并通過(guò)半定量PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Northern雜交三種技術(shù)對(duì)其卵黃蛋白

3、原的合成部位以及在卵原細(xì)胞期、初級(jí)卵母細(xì)胞小生長(zhǎng)期(簡(jiǎn)稱(chēng)小生長(zhǎng)期)、初級(jí)卵母細(xì)胞大生長(zhǎng)期(簡(jiǎn)稱(chēng)大生長(zhǎng)期)、成熟前期和成熟期的mRNA表達(dá)量進(jìn)行研究分析。
　　實(shí)驗(yàn)中通過(guò)RT-PCR,RACE等技術(shù)克隆得到中華絨螯蟹卵黃蛋白原的cDNA序列全長(zhǎng),其長(zhǎng)度為7921 bp,軟件分析后知其含有一個(gè)7689 bp的開(kāi)放閱讀框,其5’和3’的非翻譯區(qū)分別為28 bp和204 bp;將其開(kāi)放閱讀框翻譯為氨基酸序列后進(jìn)行BLASTP,與其他已知的

4、甲殼類(lèi)卵黃蛋白原序列間存在33--77％的相似性。對(duì)該序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明中華絨螯蟹與其它四種蟹類(lèi)間呈現(xiàn)較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系,預(yù)測(cè)該序列編碼一個(gè)含2562個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì),可能含有2個(gè)結(jié)構(gòu)域:參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的卵黃蛋白原N端結(jié)構(gòu)域(Vitellogenin_N);以及血管性血友病因子(von Willebrand factor)D型結(jié)構(gòu)域(VWD)。加上藍(lán)蟹、三疣梭子蟹、擬穴青蟹、銹斑蟳共5種蟹中,該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)含有氫鍵(H-b

5、ond)、α螺旋(Helices)、β折疊鏈(strands)和β轉(zhuǎn)角(Turns)四要素,且在數(shù)量上相差不大,因此,我們能進(jìn)一步推斷,在胚胎發(fā)育及早期幼體發(fā)育時(shí)期,它們對(duì)于個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育繁殖均有類(lèi)似的功能和作用。對(duì)該蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明,中華絨螯蟹和藍(lán)蟹的Vg蛋白存在膜外到膜內(nèi)和膜內(nèi)到膜外的結(jié)構(gòu),另外3種蟹僅含有從膜內(nèi)到膜外的結(jié)構(gòu),這表明在5種蟹中Vg的膜內(nèi)外運(yùn)輸模式存在差異,含有兩種膜內(nèi)外結(jié)構(gòu)的Vg可能更有利于其膜內(nèi)

6、外運(yùn)輸,這可能與其繁殖發(fā)育的生物學(xué)功能有關(guān)。
　　本研究本文運(yùn)用半定量、實(shí)時(shí)熒光定量PCR以及Northern雜交的方法,發(fā)現(xiàn)卵巢和肝胰腺均是Vg的合成位點(diǎn),證實(shí)對(duì)于十足目甲殼動(dòng)物,卵黃的發(fā)生存在雙源,即除了卵子本生通過(guò)卵內(nèi)合成(autosynthesis)外,肝胰腺作為卵巢外組織合成Vg。推斷中華絨螯蟹Vg的外源性合成始于肝胰腺,隨血液循環(huán)進(jìn)入卵巢,在卵母細(xì)胞中積累。從總體上看,Vg在肝胰腺中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于卵巢,說(shuō)明在中華絨螯

7、蟹生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,相對(duì)于卵巢,作為甲殼動(dòng)物消化、代謝器官的肝胰腺是表達(dá)Vg的主要器官,它間接參與了中華絨螯蟹發(fā)育生殖過(guò)程。另外,本實(shí)驗(yàn)表明肝胰腺的Vg表達(dá)高峰期比卵巢要出現(xiàn)得晚,該結(jié)論與其他甲殼類(lèi)動(dòng)物有所差異。
　　三種實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明,在中華絨螯蟹發(fā)育的卵原細(xì)胞期、初級(jí)卵母細(xì)胞小生長(zhǎng)期、初級(jí)卵母細(xì)胞大生長(zhǎng)期(簡(jiǎn)稱(chēng)大生長(zhǎng)期)中,Vg mRNA表達(dá)量呈上升趨勢(shì),熒光定量PCR結(jié)果表明,卵巢中五個(gè)時(shí)期Vg mRNA表達(dá)量均存在顯著性差異

8、(P<0.05),肝胰腺中除了成熟前期和成熟期外,其他時(shí)期彼此間均存在顯著性差異(P<0.05)。熒光定量PCR和RT-PCR的卵巢和肝胰腺研究結(jié)果以及熒光定量PCR的肝胰腺研究結(jié)果表明,中華絨螯蟹成熟前期中肝胰腺Vg mRNA表達(dá)含量明顯下降,這與該時(shí)期環(huán)境溫度大幅度下降有關(guān);隨著人們對(duì)Vg研究的不斷深入,研究方法越來(lái)越多,各種方法對(duì)于同一實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也不盡相同,利用各種方法的優(yōu)勢(shì)來(lái)研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可以從多方面分析比較,獲得更為準(zhǔn)確的實(shí)