轉Cherry基因寧夏灘羊體細胞核移植的研究.pdf

1、灘羊是寧夏特色肉毛兼用綿羊品種，但是，近年來由于寧夏種質資源保護工作相對滯后，灘羊存在產羔率低、純種灘羊數量不斷銳減和等現(xiàn)象。本研究擬利用屠宰場獲取灘羊卵巢，對灘羊卵母細胞的體外成熟、孤雌激活、孤雌激活胚胎及重構胚的體外培養(yǎng)進行系統(tǒng)的研究。通過探討灘羊卵母細胞在不同HMG、FSH、LH濃度和培養(yǎng)體系下卵母細胞的體外成熟的效果;分析化學激活離子霉素(Ionomycin)聯(lián)合6-二氨基嘌呤(6-DMAP)與不同電激活參數對灘羊孤雌生殖胚胎發(fā)

2、育的影響;并構建轉Cherry標記基因灘羊成纖維細胞-卵母細胞重構胚;分析其在不同融合條件下的融合率、卵裂率、桑椹胚和囊胚率，為進一步研究寧夏灘羊克隆和推動我區(qū)灘羊育種和種質資源保護工作奠定基礎。通過研究，獲得了如下結果：
　　 ⑴選用組織塊分離培養(yǎng)法，分離、純化灘羊胎兒成纖維細胞。通過性別鑒定獲得3株雄性胎兒來源的細胞，對其進行外源Cherry標記基因轉染，獲得穩(wěn)定表達外源基因的成纖維細胞;對第5代、15代、25代灘羊胎兒成纖

3、維細胞染色體計數核型分析發(fā)現(xiàn)沒有染色體缺失。
　　 ⑵采用割卵法獲取未成熟的卵母細胞，共采集9138個卵巢，培養(yǎng)27607個卵母細胞。在培養(yǎng)條件為38.5℃，5％CO2，飽和濕度下，成熟液含有TCM199+10 mg/mL BSA+100×ITS+1.5μg/mL17β-E2+2.5 mmol/mL谷氨酰胺+1 mmol/L丙酮酸鈉中添加兩種激素FSH、LH濃度為200.μg/mL和40μg/mL，第一種成熟液培養(yǎng)體系下，能夠促

4、進寧夏灘羊卵母細胞的體外成熟，成熟率為68.8％;在基礎培養(yǎng)液TCM199+10 mg/mL BSA+100×ITS+1.5μg/mL17β-E2+2.5 mmol/mL谷氨酰胺+1 mmol/L丙酮酸鈉添加一種激素HMG濃度為0.1 IU/mL第二種成熟液培養(yǎng)體系中同樣能夠促進寧夏灘羊卵母細胞的體外成熟，成熟率為69.6％。
　　 ⑶對1093個成熟卵母細胞進行電激活，得到在1600 V/cm的激活條件最適宜激活電壓條件下卵裂

5、率最高為58.5％，獲得卵裂率和囊胚率最高分別為58.5％和為19.5％;對5047個卵母細胞采用離子霉素聯(lián)合6-DMAP激活處理灘羊卵母細胞，其卵裂率囊胚率分別為81.0％和26.2％;對347個卵母細胞采用電激活聯(lián)合6-DMAP激活處理灘羊卵母細胞，其卵裂率囊胚率分別為74.1％和19.6％。研究選用離子霉素聯(lián)合6-DMAP激活法效率最高激活法進行后續(xù)實驗。在孤雌激活胚胎培養(yǎng)中mSOFaa培養(yǎng)液能使囊胚發(fā)育率達到25.0％優(yōu)于M16