家蠶中腸細胞培養(yǎng)及飼料成分刺激反應的研究.pdf

1、人工飼料養(yǎng)蠶是蠶業(yè)生產的一項重大技術革新。目前,國內外主要采用活體家蠶進行人工飼料配方及成分的物質能量代謝試驗和飼養(yǎng)試驗,但活體生物家蠶對飼料的適應性受季節(jié)、溫度、品種品系等因素的影響較大。若采用腸上皮細胞的原代培養(yǎng)物對人工飼料的配方及營養(yǎng)效用進行評價研究,則可以避免上述影響。家蠶中腸是家蠶消化器官最發(fā)達的部分,它不僅是消化吸收營養(yǎng)的場所,也是進行物質和能量代謝的重要器官。目前,在家蠶的組織研究中,中腸的研究大多集中在物質代謝和細胞化學

2、等方面,而中腸上皮細胞的原代培養(yǎng)及原代培養(yǎng)物對外來刺激的反應還鮮有報道。家蠶作為一種模式昆蟲,應用家蠶培養(yǎng)細胞進行理論研究和生產應用倍受關注。雖然早在20世紀30年代,William Tmger就開始了家蠶細胞培養(yǎng)的研究,但是到目前為止,仍沒有家蠶中腸細胞系的研究報道,這主要是缺少理想的培養(yǎng)基和科學有效的培養(yǎng)方法,特別是成功的原代培養(yǎng)方法。
　　 本實驗的研究目的在于:制備可用于家蠶細胞培養(yǎng)的去細胞血淋巴液及家蠶組織勻漿液。以家

3、蠶中腸組織為材料進行原代培養(yǎng),摸索原代培養(yǎng)的條件和方法.考察現行家蠶人工飼料主要成分對中腸細胞增殖的影響,為家蠶飼料開發(fā)研究提供細胞水平的依據。并期望最終為建立家蠶消化道細胞系,為藥物藥效的體外敏感性試驗.提供前期實驗鋪墊。主要研究內容及結果如下:
　　 1.家蠶培養(yǎng)基及培養(yǎng)用液的制備
　　 本試驗通過離心、過濾、透析等方法,獲得家蠶去細胞血淋巴液,并通過添加維生素C防止酪氨酸酶氧化。制備得到的去細胞血淋巴液,呈淡黃色,

4、透明狀,稍有粘性,經測定pH值為6.3±0.3,蛋白濃度為25.4mg/100mL。家蠶經去除頭部、消化管、馬氏管、肛門后,得到的組織通過與PBS液混合勻漿,得到白色、透明狀的家蠶組織勻漿液,經測定pH值為6.5±0.1,蛋白的濃度為69.6mg/100ml。
　　 2.家蠶中腸細胞的培養(yǎng)及生長指標的檢測
　　 本試驗以2-3齡眠期家蠶幼蟲中腸組織為材料,分別以Grace's培養(yǎng)基和家蠶組織勻漿為基礎培養(yǎng)基,家蠶去細胞血

5、淋巴液、胎牛血清、家蠶組織勻漿為輔加成分,配制6種不同營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基(①Grace's基礎培養(yǎng)基+20%(VN)家蠶組織勻漿液;②Grace's基礎培養(yǎng)基+20%(V/V)FBS;⑤Cnace's基礎培養(yǎng)基+20%(V/V)家蠶去細胞血淋巴液;④家蠶勻漿液+20%(V/V)FBS;⑤家蠶組織勻漿液+20%(VN)家蠶去細胞血淋巴液;⑥家蠶組織勻漿液);取家蠶后部絲腺來源的絲素蛋白,制備成可供細胞生長的粘附材料;對中腸細胞進行原代培養(yǎng),

6、并對成功傳代細胞的生長狀況、細胞生長曲線、細胞分裂指數、細胞接種存活率等相關指標進行檢測。通過對比不同培養(yǎng)基培養(yǎng)家蠶中腸細胞,發(fā)現以Grate's培養(yǎng)基為基礎,分別添加20%(V/V)家蠶去細胞血淋巴液和胎牛血清的實驗組,細胞能在原代接種培養(yǎng)的第25d,穩(wěn)定生長,并在70-75d,達到80%鋪瓶率。傳代培養(yǎng)后第45d,細胞達到80%鋪瓶率。通過觀察培養(yǎng)物主要由3種類型的細胞混合組成。分別為:呈扁平的梭型或卵圓型的細胞,單層生長,邊界清晰

7、;另一類細胞呈長梭型,中央有卵圓形核,排列整齊。同時還有少量的細胞呈紡錘形。通過對Grace's基礎培養(yǎng)基+20%(V/V)FBS組和Grace's基礎培養(yǎng)基+20%(VN)家蠶去細胞血淋巴液組傳代細胞的生長曲線和接種存活率的測定發(fā)現,第一次傳代培養(yǎng)的細胞生長緩慢,接種后有7-10d的潛伏期,從22-45d和20-39d分別是這兩組細胞的對數生長期。在45d和39d時,兩組細胞濃度達到頂峰,達到80%鋪瓶率。在其余3種完全培養(yǎng)基中,未觀

8、察到細胞。
　　 3.人工飼料成分對中腸細胞的刺激反應
　　 為進一步探討家蠶人工飼料中原料的安全指標,以生長對數期的中腸細胞為對象,用不同的飼料成分原液刺激細胞,測定其對細胞增殖的影響。不同比例的桑葉汁(40%、20%、10%、5%),蠶蛹蛋白(15%、10%、5%、2.5%、1%),脫脂大豆粉(15%、10%、5%、2.5%、1%),山梨酸(10%、5%、2.5%、1%、0.5%),丙酸鈣(10%、5%、2.5%、1

9、%、0.5%),氯霉素(0.02%、0.01%、0.005%、0.002%、0.001%),土霉素(0.02%、0.01%、0.005%、0.002%、0.001%)的細胞增殖試驗結果表明,桑葉各比列原液刺激細胞后平均細胞相對增殖率都大于90%,沒有細胞毒性。脫脂大豆的濃度在2.5%以下,蠶蛹蛋白的濃度在5%以下,能保持細胞的增值活性。對于山梨酸、丙酸鈣濃度大于2.5%則使細胞增值活性大幅度降低,細胞出現死亡。氯霉素和土霉素在0.005