一種復合微生物系統(tǒng)的構建及其在降解稻殼纖維素中的應用研究.pdf

1、自從日本琉球大學比嘉照夫教授于20世紀80年代初期研制出一種新型復合微生物菌劑—有效微生物群EM(EffectiveMicroorganisms)以來，復合微生物的應用現已普及到全世界包括中國在內的60多個國家，并取得了顯著的經濟效益、社會效益和生態(tài)效益。多菌種混合發(fā)酵相對單菌種發(fā)酵有很多優(yōu)勢：提高生產效率和微生物生長速度，可利用營養(yǎng)成分比較單一的廉價的農副產品，并且還可以防至發(fā)酵污染。纖維素酶是一種復合酶，由內切葡聚糖酶、外切葡聚糖纖

2、維二糖水解酶和纖維二糖酶的協同作用下才能水解成葡萄糖。目前，影響纖維素材料綜合利用的關鍵問題纖維素酶的酶解效率不高，在纖維素利用過程中產生明顯的產物(纖維二糖和葡萄糖)阻遏纖維素酶系的表達，直接影響纖維素酶系對纖維素材料的協同作用效率。為提高纖維素酶系的酶解效率，本文采用構建多菌種混合發(fā)酵體系發(fā)酵軟化具有特殊結晶結構纖維素的稻殼，一方面通過體系中各菌種產酶情況調節(jié)纖維素酶系中各組分之間的協同作用，另一方面通過體系中的一些菌種及時利用纖維

3、素酶解產物以解除底物和降解物對酶的影響。 本文的主要研究內容和結果 1、根據纖維素酶系的組成特點及作用機制和微生物的生理特性篩選生長條件相似的多菌種組成發(fā)酵稻殼的復合微生物體系：根據綠色木霉纖維素酶系組分較全，但β-葡萄糖苷酶活力比較低，而黑曲霉的β-葡萄糖苷酶活力比較高的特點，選定綠色木霉AS3.3711和黑曲霉3.316作為產纖維素酶的菌種來源，再根據啤酒酵母AS2.399、產朊假絲酵母1817和德氏乳桿菌都可利用還

4、原單糖的特性，在以后的實驗中將從這三種菌中篩選出最佳的第三種菌與前兩種菌一起復合發(fā)酵以解除產物反饋抑制作用。 2、把綠色木霉、黑曲霉分別進行單菌種發(fā)酵，初步掌握各單菌發(fā)酵稻殼的最佳發(fā)酵條件，定出以下條件作為復合微生物發(fā)酵的參考：稻殼預處理的NaOH濃度2.0％、處理溫度50℃(24h)、發(fā)酵pH5.0-5.5、發(fā)酵培養(yǎng)基含水量100％。 3、通過做對比實驗從啤酒酵母AS2.399、產朊假絲酵母1817和德氏乳桿菌中篩選出

5、最佳的第三種菌與綠色木霉和黑曲霉一起復合發(fā)酵以解除產物反饋抑制作用。結果發(fā)現，無論是FPA(filterpaperenzymeactivity)還是纖維降解率，啤酒酵母的效果最好，產朊假絲酵母次之，而德氏乳桿菌最差；且最高酶活基本上在發(fā)酵的第七天出現，而纖維降解率都是在第九天之后幾乎沒有什么變化。所以，本實驗的復合微生物體系最終選定由啤酒酵母AS2.399、綠色木霉AS3.3711和黑曲霉3.316構成。 4、一方面參考綠色木霉

6、和黑曲霉的單菌種發(fā)酵條件，一方面根據發(fā)酵需要重新設計十因素三水平的正交實驗，結果得到復合微生物發(fā)酵稻殼的十個最佳條件如下：稻殼預處理溫度30℃，NaOH濃度3％，發(fā)酵溫度30℃，黑曲霉接種時間Od(與綠色木霉同在第一天接種即與綠色木霉接種時間差為Od)，發(fā)酵pH4.5，啤酒酵母接種時間6d(比綠色木霉接種時間晚6d)，培養(yǎng)基含水量80％，綠色木霉接種量為每20g干培養(yǎng)基中接入濃度為1×108cell/ml的孢子液2ml，黑曲霉接種量也為

7、每20g干培養(yǎng)基中接入濃度為1×108cell/ml的孢子液2ml，啤酒酵母接種量為每20g干培養(yǎng)基中接入濃度為1×1010cell/ml菌液1ml。 5、在已確定的最優(yōu)發(fā)酵條件下，設計實驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的組成。由于涉及的因素比較多，僅采用正交設計各因素水平數就不能過多，而多水平實驗對于優(yōu)選培養(yǎng)基組成是必需的。所以采用正交設計和均勻設計相結合的方法對固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的無機鹽及金屬鹽成分進行優(yōu)化篩選，最后用微機對實驗數據進行處理，得

8、到兩個回歸方程，并由兩方程分別得出預測極值點和最高FPA及纖維降解率的預測值，再綜合考慮兩方程的預測極值點和生產成本選出最優(yōu)培養(yǎng)基配方為0.20％的土溫80、0.10％(NH4)2SO4、0.20％(NH2)2CO和0.08％的KH2PO4，預測FPA為5.77U/g，纖維降解率32.38％。然后，進一步作實驗對其進行驗證，實驗結果為FPA為5.64U/g，纖維降解率為28.05％，這與預測值基本相符，證明此優(yōu)化培養(yǎng)基配方是有效的。

9、 6、在最佳發(fā)酵條件下對最優(yōu)配方的稻殼培養(yǎng)基進行發(fā)酵，把復合微生物發(fā)酵和單菌種發(fā)酵作對比實驗。發(fā)現綠色木霉的最高酶活力發(fā)生在第5天，纖維降解率在第12天后幾乎沒什么變化，而黑曲霉最高酶活力卻發(fā)生在第2天，纖維降解率在6天后沒有變化，并且綠色木霉的酶活力比黑曲霉低。把黑曲霉和綠色木霉兩種菌混合，最高FPA發(fā)生在第6天，纖維降解率在9天之后無變化，最高酶活比綠色木霉高，但比黑曲霉低，而纖維降解率比任一單菌高。當把綠色木霉和黑曲霉及酵母三

10、種菌混合培養(yǎng)時，發(fā)現最高酶活力發(fā)生的時間延長到了第7天，但其酶活力仍比黑曲霉單菌種發(fā)酵以及黑曲霉與綠色木霉混合發(fā)酵的低，比綠色木霉單菌種發(fā)酵高，而纖維降解率則在10天后沒有什么變化，且比兩種單菌及其混合發(fā)酵都高。這主要是酵母菌的加入解除了產物的反饋抑制，從而大大提高了纖維降解率。通過此實驗驗證了本課題構建的由啤酒酵母AS2.399、綠色木霉AS3.3711和黑曲霉3.316組成的復合微生物體系在實際中的應用符合了我們最初的理論設計，三菌