柑橘試管苗種質(zhì)保存及其microRNA鑒定.pdf

1、柑橘是熱帶、亞熱帶最重要的果樹之一,具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著科技的發(fā)展,人們?cè)絹碓秸J(rèn)識(shí)到種質(zhì)資源保存的重要性。離體種質(zhì)保存成為柑桔種質(zhì)保存的有效手段而受到國(guó)內(nèi)外的重視。本試驗(yàn)主要開展如下研究:①以蘆柑珠心胚試管苗為材料,進(jìn)行了離體保存體系的優(yōu)化；②67份柑橘種質(zhì)珠心胚試管苗的離體保存；③柑桔試管苗葉片GPX基因的克?。虎芨探垭x體保存試管苗葉片microRNA的分離與鑒定,旨在保存柑桔種質(zhì)資源,并為研究其離體保存分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。主要研究

2、結(jié)果如下:
　　 1.蘆柑試管苗保存體系的優(yōu)化
　　 以初代培養(yǎng)一個(gè)月的蘆柑試管苗為主試材料,將其莖段切成1.5-2cm,每一段包括一個(gè)健壯的節(jié),采用L9(34)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),探討基本培養(yǎng)基、多效唑濃度和甘露醇濃度對(duì)蘆柑試管苗保存的影響,篩選出最佳培養(yǎng)基。結(jié)果表明:1／2MS+1.0 mg·L-1多效唑+1.0 g·L-1甘露醇最有利于蘆柑試管苗的保存,其次為1／4MS+1.0 mg·L-1多效唑+5.0 g·L-1甘露

3、醇,而MS+1.0mg·L-1多效唑+10 g·L-1甘露醇最不利于蘆柑試管苗的保存。在探討的這三個(gè)因素中,甘露醇濃度對(duì)蘆柑試管苗保存的影響程度最大,而多效唑和基本培養(yǎng)基則效果相當(dāng)。當(dāng)甘露醇濃度為10 g·L-1時(shí)對(duì)蘆柑試管苗保存不利,而多效唑濃度為1.0 mg·L-1時(shí)則有利于其保存,適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)饑餓有利于保存。
　　 2.67份柑桔種質(zhì)資源的試管苗離體保存
　　 本研究在繼續(xù)保存原有43份柑橘種質(zhì)資源的同時(shí),新增資源2

4、4份,分別為紅桔、檸檬橙(平頂)、檸檬橙(凸頂)、立花桔、瓊中綠橙、本地早、蘆芝柚、四季柚、早3號(hào)、野生桔、血橙、臍橙、金彈1、金彈2、金彈3、滑皮金柑、金柑35B、金柑58B、金柑59、金柑59B、金柑72B、金柑80B、金柑101B和金柑105。在接種一個(gè)月后對(duì)新增加的24份資源中的18份的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)除金彈1和滑皮金柑外,其它柑橘徒長(zhǎng)嚴(yán)重,且頂端優(yōu)勢(shì)明顯；立花桔、檸檬橙、臺(tái)灣紅桔等10份資源葉片充分展開,其它8份資

5、源葉片未充分展開,葉片大小差異較大；根均生長(zhǎng)健壯,但長(zhǎng)度各異,差異較大。
　　 3.蘆柑試管苗GPX基因的克隆
　　 以蘆柑試管苗的葉片為材料,采用改良的Trizol法提取總RNA,采用同源克隆的方法對(duì)蘆柑試管苗GPX基因進(jìn)行克隆。保守區(qū)引物直接采用陳義挺(2009)在龍眼上設(shè)計(jì)的GPX保守區(qū)引物,通過RT-PCR擴(kuò)增出保守區(qū)序列,長(zhǎng)度為387 bp(包含上下游引物),與己登錄NCBI的多種植物的GPX基因同源性較高,其

6、中與蓖麻的同源性最高,達(dá)86％；根據(jù)已經(jīng)獲得的GPX基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)3’RACE引物,經(jīng)過兩輪巢氏PCR擴(kuò)增,得到3’端序列,長(zhǎng)度為500 bp；采用DNAMAN6.0軟件將得到的保守區(qū)和3’端的序列進(jìn)行拼接,得到一條599 bp長(zhǎng)的片段。已在GenBank上登錄,登錄號(hào)為:GU130596.1。
　　 4.利用solexa測(cè)序技術(shù)鑒定柑橘試管苗葉片中的miRNAs
　　 本研究第一次對(duì)柑橘試管苗葉片進(jìn)行小RNA文庫構(gòu)

7、建和Solexa測(cè)序。以蘆柑試管苗葉片發(fā)育過程中的三個(gè)時(shí)期的葉片為材料,提取小分子RNA,將其均勻混合,進(jìn)行小RNA文庫構(gòu)建和Solexa測(cè)序。研究結(jié)果表明:共得到Unique序列3,065,625條,其中miRNA占0.68％；10.44％的Unique序列能在柑橘基因組中找到匹配位點(diǎn)；柑橘sRNA以24 nt的長(zhǎng)度作為主要存在方式；柑橘試管苗葉片發(fā)育過程中Unique sRNA的表達(dá)豐度存在巨大差異,從一次到數(shù)萬次不等,其中大部分為

8、低豐度表達(dá)；總共鑒定了302個(gè)已知的柑橘miRNA,構(gòu)成117個(gè)家族,不同家族間成員數(shù)量存在巨大差異；保守miRNA長(zhǎng)度集中在21 nt；雙子葉植物特有的miR163在本研究中未檢測(cè)到,而被認(rèn)為是單子葉植物所特有的miRNA437／444／528／112211126／1132在本研究中得到發(fā)現(xiàn)；另外總共獲得76個(gè)候選的miRNA,其中有28個(gè)miRNA含單個(gè)基因座,另48個(gè)miRNA具備多個(gè)基因座；76個(gè)候選miRNA中有72個(gè)預(yù)測(cè)到了