ES小鼠的制備及SP-了mRNA的表達分析.pdf

1、ES小鼠屬于克隆小鼠,是研究人類疾病的最佳模式動物。利用四倍體胚胎補償技術可以得到完全由ES細胞發(fā)育而來的小鼠,即ES小鼠。盡管四倍體胚胎補償技術獲得了大家的公認,但采用這一技術制備ES小鼠的效率較低,其影響因素很多。如四倍體胚胎的制作方法和遺傳背景、體外培養(yǎng)環(huán)境、ES細胞的傳代次數等都是影響獲得:ES小鼠的重要因素。四倍體胚胎發(fā)育階段也是其中的一個重要因素,關于四倍體胚胎發(fā)育階段對ES小鼠制備的研究目前還沒有。
　　 新生有活

2、力的ES小鼠(有短暫的呼吸現象)并非都能發(fā)育至成年,有相當一部分在出生后立刻表現進行性呼吸困難和青紫呼吸衰竭征象,其壽命不會超過l小時,肺部病理表現為肺泡壁增厚和肺泡擴張不全,而且,這種呼吸衰竭征是導致新生ES小鼠死亡的主要疾病。死于呼吸衰竭的新生ES小鼠幾乎沒有SP-B蛋白的表達,即使那些外觀正常的成年ES小鼠的SP-B蛋白表達水平也很低。因此SP-B基因很可能是一個確保新生克隆動物存活至成年的關鍵基因。
　　 通過2-細胞胚

3、胎電融合法制備四倍體胚胎,采用顯微注射方法將ES細胞分別注入1-細胞、4-細胞、囊胚三個發(fā)育階段的四倍體胚胎中。所用ES細胞分別為雜交系B6D2F1×129／Sv和近交系C578L／6J,經胚胎移植和剖腹產獲得ES小鼠。結果顯示,雜交ES細胞注射四倍體囊胚獲得40只ES小鼠,效率顯著高于近交系ES細胞以及其他發(fā)育階段的四倍體胚胎,ES小鼠與B6D2F1×129／Sv雜交小鼠毛色一致且具有正常生殖能力。實驗中,我們還研究了E型鈣粘連蛋白抗

4、體(ECCD-1)對胚胎體外發(fā)育的影響,并利用ECCD-1處理8細胞胚胎注射ES細胞方法產生嵌合體。結果表明,ECCD-1阻止了胚胎分裂球間的連接,推遲致密化過程,但不影響囊胚ICM的形成。ECCD-1培養(yǎng)8-細胞胚胎注射ES細胞也能獲得完全由ES細胞發(fā)育而來的小鼠。
　　 分別取14只死于呼吸衰竭的新生ES小鼠和14只新生正常小鼠(相同遺傳背景)的肺組織,提取RNA。用半定量PCR方法檢測SP-B mRNA的表達水平,結果表明