檉柳eIF5A基因的抗逆功能研究.pdf

1、干旱、鹽堿脅迫是影響植物生長發(fā)育的主要因素,應(yīng)用基因工程手段對植物進行遺傳改良已成為提高植物抗逆性的有效途徑。研究抗逆相關(guān)基因的抗逆功能是基因工程抗性育種的前提。eIF5A是目前發(fā)現(xiàn)的惟一含有特殊氨基酸(hypusine)殘基的蛋白質(zhì),其具體的生物學(xué)功能尚不清楚。已有研究表明,eIF5A參與植物細(xì)胞的諸多生命活動,并參與植物的抗逆反應(yīng)。為研究eIF5A基因的功能,本研究對來自檉柳的eIF5A基因(TaeIF5A)的表達和功能進行了初步研

2、究。
　　 利用實時定量RT-PCR技術(shù),對不同脅迫條件下TaeIFSA基因在檉柳中的時序表達進行了分析。結(jié)果表明,TaeIFSA基因能夠應(yīng)答NaCl、PEG、NaHCO3、CdCl2以及ABA脅迫,不同脅迫條件下TaeIFSA基因的表達模式各不相同,并且具有一定的組織器官表達特異性。利用基因槍介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化技術(shù),將TaeIF5A-GFP融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)瞬時表達,在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)都觀察到綠色熒光,說明TaeIF5A表達定

3、位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。
　　 利用TAIL-PCR技術(shù),克隆得到長度為1550bp的TaeIFSA啟動子。序列分析表明,該啟動子區(qū)包含多種與逆境響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件,如MYB、MYC、GTI、WRKY等。將elF5A啟動子構(gòu)建到pCAMBIA1301中,使其驅(qū)動GUS表達,將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌中,用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法瞬時轉(zhuǎn)化煙草,GUS染色顯示轉(zhuǎn)基因瞬時表達的煙草外植體有藍色斑點,表明該啟動子具有啟動表達的活性。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花

4、法轉(zhuǎn)化擬南芥,通過對種子的潮霉素抗性篩選獲得轉(zhuǎn)化擬南芥,GUS染色結(jié)果表明,eIF5A基因主要在根部表達,在葉片中也有少量表達。
　　 將TaeIFSA構(gòu)建到酵母表達載體pYES2中,重組質(zhì)粒pYES2-TaeIFSA轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVScl,比較重組和非重組酵母在NaCl、KCl、MgCl2、ZnCl2、CuSO4、CdCl2、H202、山梨醇、Na2CO3和NaHCO3脅迫下的生長狀況,驗證TaeIFSA對不同非生物脅迫的抵

5、抗能力。結(jié)果表明TaeIFSA對包括鹽、鹽堿、干旱、過氧化物以及重金屬在內(nèi)的多種脅迫具有抵抗能力。
　　 為了進一步驗證逆境脅迫下TaeIFSA基因的功能,將TaeIFSA基因構(gòu)建到35S啟動子驅(qū)動的植物表達載體pROKⅡ,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化山新楊。PCR、Southern雜交和Northern雜交檢測表明TaeIFSA基因整合到山新楊基因組中,并能夠表達。選取10個轉(zhuǎn)基因株系組培苗進行了0.6％NaCl脅迫試驗,比較非轉(zhuǎn)基因

6、和轉(zhuǎn)基因山新楊地上和地下部分的長度,結(jié)果表明TaeIFSA基因提高了山新楊的耐鹽能力,其中轉(zhuǎn)基因株系L2和L3耐鹽表現(xiàn)較其它各株系好。對L2、L3和非轉(zhuǎn)基因山新楊組培苗進行ZnCl2、CuSO4、CdCl2、山梨醇及NaHCO3脅迫試驗,發(fā)現(xiàn)非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因山新楊在含5mMNaHCO3的培養(yǎng)基中無法生長而死亡,對非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因山新楊的根長和高度的比較表明,TaeIFSA基因不同程度的提高了山新楊對重金屬和干旱的耐受能力。將非轉(zhuǎn)基因和1

7、0個轉(zhuǎn)基因株系移栽至大棚,待樹高達到約60～70cm時對其進行0.8％NaCl,分析鹽脅迫條件下非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因山新楊的可溶性蛋白含量、POD活性、SOD活性以及相對電導(dǎo)率的變化。結(jié)果表明,鹽脅迫下,多數(shù)轉(zhuǎn)基因株系的可溶性蛋白含量、POD活性、SOD活性比非轉(zhuǎn)基因山新楊高,而相對電導(dǎo)率低于非轉(zhuǎn)基因山新楊。此外,通過對鹽脅迫下非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因各株系的相對高生長和地徑增長的比較發(fā)現(xiàn),多數(shù)轉(zhuǎn)基因株系的相對生長量高于非轉(zhuǎn)基因山新楊,說明TaeI

8、FSA基因的表達提高了轉(zhuǎn)基因山新楊的耐鹽能力。
　　 為探索TaeIF5A表達的分子機制,首先構(gòu)建了檉柳cDNA文庫,并轉(zhuǎn)化到酵母中。并將TaeIFSA基因構(gòu)建到Bait載體,利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選檉柳cDNA文庫中與TaeIF5A相互作用的蛋白。共獲得了6個與TaeIF5A互作的蛋白,其中3個通過進一步驗證證明其具有相互作用,一個是未知功能蛋白,一個是與細(xì)胞生長和延伸有關(guān)的木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶/水解酶(XTHs)前體蛋白,另一

9、個是與生長素調(diào)節(jié)有關(guān)的ARF GTP酶激活子。TaeIF5A與木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶/水解酶前體蛋白和ARF GTP酶激活子蛋白發(fā)生互作,說明TaeIF5A可能在細(xì)胞的生長發(fā)育、細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)變化以及植物對非生物逆境脅迫的響應(yīng)過程中發(fā)揮作用,但其互作的具體過程及意義還有待于進一步研究。
　　 選擇TaeIFSA啟動子中與逆境響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件,GT-1、MYC/E-box和W-box,分別將它們的序列以3次串聯(lián)重復(fù)的形式構(gòu)建到報

10、告載體pHIS2中,利用酵母單雜交系統(tǒng)篩選TaeIFSA基因的上游調(diào)控基因。其中,篩選到可能與GT-1順式作用元件互作的6個基因。其中,有4個蛋白是與葉綠體相關(guān)的蛋白,其它的兩個分別是參與DNA修復(fù)的泛素結(jié)合酶,另一個是在植物的生長發(fā)育中起重要作用的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。篩選獲得了7個可能與MYC/E-box順式作用元件互作的基因,其中有4個是與光合作用相關(guān)的蛋白;除一個未知功能蛋白外,另外兩個分別是羥甲基谷酰輔酶A還原酶,它是異戊二

11、烯代謝途徑中的限速酶;參與識別并結(jié)合DNA激活轉(zhuǎn)錄過程的RNA聚合酶β'亞基。獲得了5個可能與W-box順式作用元件互作的蛋白,其中一個是與植物干早、高鹽和低溫等逆境抗性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子AP2轉(zhuǎn)錄因子;一個是與生物體DNA復(fù)制過程密切相關(guān)的MCMs家族中重要的一員,微小染色體維系蛋白3;另一個是果糖二磷酸醛縮酶,它是植物光合作用和呼吸作用中的關(guān)鍵酶之一;還有對泛素化修飾的特異性和精確時空性起關(guān)鍵作用的泛素結(jié)合酶E2;此外,與MYC/E-b