利用IVIAT篩選腸炎沙門(mén)菌體內(nèi)感染相關(guān)因子.pdf

1、腸炎沙門(mén)菌是在全球范圍內(nèi)沙門(mén)菌感染中備受關(guān)注的血清型之一,是重要的食源性病原菌。食入被污染的肉制品(主要是禽類(lèi))及蛋制品是人類(lèi)感染腸炎沙門(mén)菌的主要來(lái)源。目前腸炎沙門(mén)菌對(duì)家禽的致病機(jī)制的研究雖然取得了一定的進(jìn)展,但仍處于初級(jí)階段。雖然控制家禽腸炎沙門(mén)菌病的商品化疫苗很多,但達(dá)到完全保護(hù)力的卻沒(méi)有。因此加強(qiáng)對(duì)腸炎沙門(mén)菌致病機(jī)制、新的藥物靶點(diǎn)及疫苗候選株的研究顯得尤為重要。
　　 體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)(IVIAT)是一種利用宿主感染血清篩

2、選體內(nèi)表達(dá)的抗原基因的技術(shù),其融合了免疫學(xué)與基因組學(xué)原理和方法,鑒定出的基因可能在病原體感染宿主的過(guò)程中起重要作用,為診療技術(shù)及疫苗研發(fā)等提供新線(xiàn)索。
　　 1.腸炎沙門(mén)菌基因組表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建
　　 首先,提取高純度的腸炎沙門(mén)菌CMCC50041基因組,用限制性?xún)?nèi)切酶Sau3AⅠ對(duì)基因組進(jìn)行不完全酶切,使所得片段在0.4-2.7kb范圍內(nèi),切膠回收酶切片段。其次,用Sau3AⅠ的同尾酶BamHⅠ酶切誘導(dǎo)型表達(dá)載體pET3

3、0-a/b/c(+),再用去磷酸化酶SAP去除載體5'-末端磷酸基,沉淀回收。然后,用T4連接酶將基因組片段與處理過(guò)的載體連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至高效感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α,并用載體特異性引物檢測(cè)片段插入效率及大小分布情況,提取質(zhì)粒保存于-70℃。結(jié)果顯示,基因組片段插入效率達(dá)到90％以上且分布均勻,所構(gòu)建的文庫(kù)的庫(kù)容量為1.68×105個(gè)克隆,可覆蓋基因組接近5次。
　　 2.利用IVIAT篩選腸炎沙門(mén)菌的體內(nèi)感染相關(guān)因

4、子
　　 制備雞抗血清,選取高滴度血清混合,分別用CMCC50041和大腸桿菌全菌、裂解上清和分泌蛋白吸附血清,然后用CMCC50041和大腸桿菌的全菌抗原、裂解上清以及CMCC50041脂多糖(LPS)進(jìn)行ELISA測(cè)定,以評(píng)價(jià)吸附效果。采用斑點(diǎn)免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行IVIAT篩選,經(jīng)過(guò)初篩、SDS-PAGE及二次篩選后確定陽(yáng)性克隆。最后對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序,Blast分析確定其功能。結(jié)果顯示,篩選得到57個(gè)陽(yáng)性克隆,測(cè)序比對(duì)后確定了

5、43個(gè)編碼序列,分別涉及到生物大分子的合成和降解、能量代謝相關(guān)分子、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、調(diào)控因子、毒力、其它類(lèi)和功能未知的蛋白等7類(lèi),篩選所得序列參與了細(xì)菌在體內(nèi)生長(zhǎng)、繁殖和致病等相關(guān)的過(guò)程。
　　 3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腸炎沙門(mén)菌感染相關(guān)因子的體內(nèi)外表達(dá)差異
　　 本實(shí)驗(yàn)采用SYBR(R)Green實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)法,通過(guò)相對(duì)定量分析(2-△△CT)來(lái)比較目的基因體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)錄水平差異。根據(jù)IVIAT篩選得

6、到的43個(gè)編碼序列,按其類(lèi)別隨機(jī)選取10個(gè)基因(bigA、metQ、SEN3752、fadJ、rlpA、gipA、SEN2804、SEN3610、nadR和ssaD)進(jìn)行試驗(yàn)。以CMCC50041靜脈接種雞,分別在感染后12、24、36和48hr檢測(cè)上述基因在雞體內(nèi)的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:除基因fadJ外,大部分基因在這四個(gè)時(shí)間段的mRNA水平相對(duì)于體外均有所上調(diào)。其中,多數(shù)基因在體內(nèi)表達(dá)呈現(xiàn)一種波動(dòng)性,如metQ、bigA、glpA、S