CYP19和OSP-1卵巢特異表達(dá)啟動(dòng)子克隆與檢測(cè).pdf

1、組織特異表達(dá)的啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)基因載體結(jié)構(gòu)中的重要調(diào)控元件。本研究克隆了水牛、黃牛CYP19啟動(dòng)子0.9k和1.6k各兩個(gè)片段，大鼠卵巢特異性啟動(dòng)子(OSP-1)片段，并構(gòu)建了真核表達(dá)載體在細(xì)胞水平進(jìn)行了檢測(cè)。參考GenBank發(fā)布的黃牛CYP19基因exon2序列和大鼠OSP-1序列，設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，以黃牛、水牛和大鼠基因組為模板，PCR擴(kuò)增獲得5個(gè)相應(yīng)長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段，經(jīng)克隆、測(cè)序和序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，水牛和黃牛相應(yīng)片段與已知序列的相似性

2、分別為95％、99％，大鼠的為96％，初步證明獲得的片段為預(yù)期設(shè)計(jì)的啟動(dòng)子區(qū)。雙酶切將5個(gè)啟動(dòng)子片段定向克隆到去除CMV的pEGFP-N1載體，構(gòu)建成5個(gè)真核表達(dá)載體pHCYP19-0.9-EGFP-N1、pSCYP19-0.9-EGFP-N1、pHCYP19-1.6-EGFP-N1、pSCYP19-1.6-EGFP-N1和pOSP-1-EGFP-N1.
　　 應(yīng)用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)將載體分別轉(zhuǎn)染水

3、牛的顆粒細(xì)胞、乳腺上皮細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞，并于轉(zhuǎn)染后12h，24h和48h在熒光顯微鏡下觀察EGFP表達(dá)情況。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pOSP-1-EGFP-N1的水牛顆粒細(xì)胞，12h后可觀測(cè)到EGFP的表達(dá)，24h后表達(dá)EGFP的細(xì)胞增多，48h后EGFP表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量驟減。轉(zhuǎn)染pHCYP19-0.9-EGFP-N1和pSCYP19-0.9-EGFP-N1的顆粒細(xì)胞，僅在轉(zhuǎn)染后24h觀測(cè)到少量表達(dá)EGFP的細(xì)胞，且熒光較弱，48h后基本觀察不

4、到EGFP表達(dá)的細(xì)胞；轉(zhuǎn)染pHCYP19-1.6-EGFP-N1和pSCYP19-1.6-EGFP-N1載體后沒(méi)有觀察到EGFP表達(dá)的細(xì)胞，5種載體轉(zhuǎn)染乳腺上皮細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞，均未觀察到EGFP表達(dá)的細(xì)胞。結(jié)論：(1)應(yīng)用PCR擴(kuò)增獲得了黃牛CYP19啟動(dòng)子(935 bp，1571bp)，水牛CYP19啟動(dòng)子(945bp，1586bp)和大鼠OSP-1啟動(dòng)子(480bp)片段；(2)其中黃牛、水牛的CYP19啟動(dòng)子(0.9k)和大