魚類感染兩種新型病毒SGIV和SVCV-A1后免疫相關(guān)基因的表達分析和功能初步研究.pdf

1、1.石斑魚是我國廣東等南方沿海各省的名貴海水養(yǎng)殖魚類。虹彩病毒是近年來全球范圍內(nèi)最嚴重的魚類傳染性病毒之一，至今已感染包括石斑魚在內(nèi)的100多種養(yǎng)殖魚類，造成嚴重經(jīng)濟損失。由于缺乏養(yǎng)殖石斑魚的遺傳背景和基因組信息，因而對石斑魚抗病毒和免疫相關(guān)的功能基因了解甚少，尚不清楚石斑魚宿主與虹彩病毒相互作用的分子機制，。在擁有近海實驗基地養(yǎng)殖系統(tǒng)和病毒基因組數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)上，首次利用抑制性消減雜交(SSH)結(jié)合基因芯片和DNA微陣列技術(shù)，通過研究分析

2、石斑魚與虹彩病毒相互作用的分子機制，發(fā)現(xiàn)并鑒定新的石斑魚抗病毒功能基因。
　　 (1)利用抑制性消減雜交(SSH)結(jié)合基因芯片技術(shù)篩選石斑魚與感染和免疫相關(guān)的功能基因。本研究對石斑魚在虹彩病毒感染前后的脾組織樣品進行抑制削減雜交，成功構(gòu)建了2個石斑魚感染SGIV的SSH文庫。并對結(jié)果進行克隆測序、拼接和比對，結(jié)果顯示差異表達基因數(shù)量共計413個，從中發(fā)現(xiàn)和篩選石斑魚與抗病毒和免疫相關(guān)的基因有20多個：抗菌肽、熱休克A蛋白、TLR

3、、pleurocidin-like peptide Hb26、補體成分C9、補體成分C3、C型凝集素、泛素攜帶蛋白E2-C、免疫球蛋白u、RNA聚合酶Ⅱ延伸因子、血紅蛋白β鏈、MHC I受體和β胸腺素、TCTP蛋白、MHC、HLA、DPB、細胞色素b等。
　　 (2)應(yīng)用基因芯片技術(shù)將差異表達的413個ESTs制作成DNA微陣列基因芯片，用感染SGIV病毒后不同時間點的石斑魚肝、脾、腎組織的cDNA和DNA微陣列芯片進行雜交，掃

4、描感染樣品的信號并分析在感染和復(fù)制過程中，病毒對石斑魚宿主基因的動態(tài)調(diào)控，進一步確定SSH篩選到的部分基因的差異，并發(fā)現(xiàn)不同時間水平表達量的差異。應(yīng)用Real-time RT-PCR對篩選到的部分石斑魚抗病毒新基因進行時態(tài)鑒定和功能驗證分析。此外，選擇部分基因進行克隆表達、以及魚類細胞培養(yǎng)病毒感染抑制系統(tǒng)分析和其免疫和抗病功能方面的初步研究。
　　 此研究在病毒和宿主兩個層次上，通過揭示病毒感染致病以及宿主防御的分子機制，發(fā)現(xiàn)與

5、感染有關(guān)的免疫和抗病毒新功能基因，對于這些基因與相關(guān)的信號通路、及其在機體中的作用通路的研究將有助于了解病毒感染的病理變化機制。鑒定本實驗發(fā)現(xiàn)的石斑魚抗病毒和免疫相關(guān)的新功能基因，為有效的抗病毒新對策提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。。
　　 2.Spring viraemia of carp virus(SVCV)作為一種重大魚類病原，最初發(fā)現(xiàn)于歐洲鯉魚養(yǎng)殖業(yè)，可導(dǎo)致鯉魚的相互感染和交叉感染。SVCV-A1病毒株來源于中國大陸已被成功分

6、離，并且本實驗室已成功建立了SVCV-A1感染斑馬魚(Danio rerio)的感染模型。斑馬魚(Danio rerio)已經(jīng)成為一種用于研究脊椎動物發(fā)育學(xué)遺傳學(xué)的模型生物，目前，隨著斑馬魚全基因組序列的成功建立和深入研究，斑馬魚已經(jīng)進一步作為模型用于人類疾病，癌癥和免疫學(xué)的研究。斑馬魚作為感染模型已經(jīng)得到了長足關(guān)注和不斷進步。
　　 為了研究病毒感染過程中肝臟的發(fā)病機理，捕獲肝臟炎癥反應(yīng)的分子水平信號和轉(zhuǎn)錄表達狀況，深入探究病

7、毒感染引起的分子免疫機理。SVCV-A1用來感染斑馬魚成魚，在24hr,48hr和96hr獲取其肝臟組織。進行斑馬魚全基因組芯片的表達.和組織顯微病變和相關(guān)功能蛋白的免疫共沉淀觀察。觀察結(jié)果表明：SVCV-A1感染24小時的斑馬魚肝臟細胞并無明顯的組織損傷，感染48小時的肝臟組織觀察到一定的損害，感染96小時時斑馬魚肝臟組織嚴重損傷且細胞形態(tài)腫大、形狀畸變、數(shù)量減少甚至出現(xiàn)了空泡。通過對肝實質(zhì)細胞的定量分析表明在感染96小時其形態(tài)變化的

8、差異極顯著。免疫組化沉淀結(jié)果顯示SVCV的感染造成E-Cadherin的表達或者功能損失，細胞胞間連接變形；高表達量的cytokeratin說明感染造成的化膿和組織嚴重變態(tài)。凋亡原位檢測(Apop-Tag)染色結(jié)果顯示，SVCV感染24小時的斑馬魚肝臟組織已經(jīng)發(fā)生細胞凋亡，96hr時肝臟組織細胞發(fā)生嚴重的細胞凋亡。Periodic acid-Schiff(PAS)染色顯示，病毒的感染過程伴隨有肝臟細胞中肝糖內(nèi)容物明顯減少和肝糖原代謝的紊

9、亂。此研究結(jié)果顯示病毒感染過程中，伴隨有不斷和加劇的細胞凋亡發(fā)生，細胞之間的相互作用也因為粘接蛋白的破壞遭受破壞、上皮細胞骨架的形態(tài)也不斷的惡化，同時造成嚴重失調(diào)或者紊亂的肝糖量代謝(glycogen，glycoprotein，proteoglycans)。
　　 斑馬魚全基因組芯片實驗的結(jié)果：在病毒感染24hr、48hr和96hr的肝臟組織中，920，348和507個基因被發(fā)現(xiàn)具有極其明顯的差異表達(p-Value＜0.005

10、)。其中有28個基因被發(fā)現(xiàn)持續(xù)性的極顯著性差異表達，推測這些基因可能是病毒感染的引起病變的biomarker基因。部分基因的表達量通過Realtime-PCR驗證結(jié)果與芯片的結(jié)果極其一致。利用在線WebGestalk分析和通過GSEA比較全部基因芯片的所有基因的表達量結(jié)果一致顯示：差異表達基因的功能主要錨定在重要的信號通路和作用機制中：其中最為有意義的有氨基酸、嘌呤代謝途徑、脂肪酸代謝途徑、MAPK、PPAR、TLR、和細胞凋亡信號通路

11、、慢性骨髓白血病、胰腺癌疾病等。
　　 SVCV感染的斑馬魚肝臟病變信息和兩種細菌沙門氏菌(Salmonella typhimurium)和分支桿菌(Mycobacterium marinum)感染斑馬魚的基因組芯片信息結(jié)果比較結(jié)果表明了細菌性感染和病毒性病變過程中，部分基因在轉(zhuǎn)錄水平具有一致性，但也有特異性。SVCV感染的斑馬魚肝臟病變信息與水泡性口炎病毒(VSV)感染的人星形膠質(zhì)細胞調(diào)控機制、TGF-KO小鼠肝臟調(diào)控機制和致

12、癌物誘導(dǎo)的斑馬魚肝臟腫瘤途徑具有最近的一致性。其中有關(guān)細胞凋亡、組織缺氧和蛋白降解相關(guān)的調(diào)控基因變化高度相似。
　　 通過WebGestalk和GSEA軟件分析的結(jié)果比較一致，篩選到大量的具有研究價值的信號通路和代謝機制的相關(guān)信息，通過組織顯微病變觀察和部分功能蛋白的免疫組織化學(xué)染色方法檢測充分證實其變化。本研究所得信息將為更深入研究宿主防御機制和與病毒感染的復(fù)雜機制提供有力方向和途徑，更為斑馬魚作為一種有效地模式生物用來研究病