凡納濱對蝦溶菌酶基因在大腸桿菌和酵母中的重組表達和活性檢測.pdf

1、凡納濱對蝦溶菌酶（Litopenaeus vannamei lysozyme，LvLys）是機體先天免疫系統(tǒng)中一個重要的效應因子，參與機體多種免疫反應，在溶菌過程中形成了一個水解體系，破壞和消除侵入體內(nèi)的病原，從而實現(xiàn)機體的免疫防御，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤的作用以及止血、消腫、防腐和加快組織修復等功能。溶菌酶廣泛存在于動物、植物和微生物中，是一種天然的抗菌劑，能特異性地作用于N-乙酰葡萄糖胺（N-acetylglucosamine，N

2、AG）和N-乙酰胞壁酸（N-acetylmuramic acid，NAM）之間的β-1，4糖苷鍵，破壞肽聚糖支架，使微生物細胞在內(nèi)部滲透壓的作用下漲裂，細胞質(zhì)外泄，最終導致細胞死亡。溶菌酶對革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌有很好的抑菌作用，對人和動物的細胞則不發(fā)生溶菌作用，被WHO和許多國家認定為無毒、無害、安全的添加劑，被越來越廣泛地應用于醫(yī)藥、生物技術(shù)、食品以及動物生產(chǎn)中。水產(chǎn)動物溶菌酶按其來源分為三類：c型溶菌酶、g型溶菌酶和i型溶

3、菌酶，凡納濱對蝦溶菌酶屬于c型溶菌酶。通常凡納濱對蝦溶菌酶是從凡納濱對蝦血液中少量提取獲得，由于來源困難，不能進行工業(yè)化生產(chǎn)，而采取DNA重組技術(shù)，從原核或真核表達系統(tǒng)中生產(chǎn)凡納濱對蝦溶菌酶是解決其供需矛盾的有效途徑。 本研究通過采集凡納濱對蝦血淋巴，從血細胞中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴增凡納濱對蝦溶菌酶基因（稱為LvLys基因）的開放閱讀框cDNA序列，將其克隆至pMD18-T載體中，經(jīng)過篩選鑒定后，將重組質(zhì)粒pMD18-

4、T/LvLys進行序列測定。然后將測序正確的基因序列用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，酶切后的目的基因與通過同樣雙酶切的表達載體pET-28a（+）連接，從而構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28（a+）/LvLys，并將其轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，通過IPTG進行誘導表達和親和純化，得到了純化的重組溶菌酶，并進行了抑菌活性檢測。同時，在溶菌酶原核表達實驗的基礎上，通過設計帶有KpnⅠ和XbaⅠ酶切位點的一對引物擴增出凡納濱對蝦

5、溶菌酶基因的全基因片段，然后將目的基因片段克隆至巴氏畢赤酵母分泌型表達載體pPIC6a中，構(gòu)建重組表達載體pPIC6aA/LvLys，經(jīng)過BamHⅠ和SacⅠ雙酶切后與經(jīng)過同樣雙酶切的pAO815質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pAO815-pPIC6aA/LvLys，重組質(zhì)粒經(jīng)SacⅠ線性化后，通過電擊轉(zhuǎn)化至巴氏畢赤酵母GS115細胞內(nèi)，通過G418篩選和PCR檢測轉(zhuǎn)化子，陽性克隆經(jīng)甲醇誘導進行表達。 結(jié)果表明，通過SDS-PAGE檢測